鴨大腸桿菌與鴨多殺性巴氏桿菌融合菌株DB4免疫原性研究.pdf

1、目前，大腸桿菌病和禽霍亂是禽類常見疾病。抗生素的不合理使用導(dǎo)致耐藥性嚴(yán)重，藥物治療效果不理想，因此研制有效的疫苗來預(yù)防細(xì)菌性傳染病就越來越受到重視并被廣泛的采用。李木子等利用鴨大腸桿菌ZYD2(O78)和多殺性巴氏桿菌YB2(5∶A)制備的融合菌株，具有雙親本的遺傳物質(zhì)并能夠穩(wěn)定遺傳[1]。本研究挑選其中一株DB4制作滅活疫苗，接種實(shí)驗(yàn)鴨，從細(xì)胞免疫和體液免疫兩個方面檢測實(shí)驗(yàn)鴨的免疫水平[2]，以期通過一次免疫即能產(chǎn)生對兩種疾病的免疫力

2、，為鴨大腸桿菌病與鴨霍亂的疫苗制備提供更簡便的途徑，簡化免疫程序。本文所開展的研究和取得的結(jié)果如下:
　　1.本試驗(yàn)從李木子融合成功的5株菌種選取含有雙親本菌株部分外膜蛋白A(OmpA)基因和部分外膜蛋白H(OmpH)基因的融合菌株DB1和DB4，在含20μg/mL新霉素的麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)純化，革蘭氏染色鏡檢菌體形態(tài)，微量生化反應(yīng)，對小鼠進(jìn)行分組攻毒，從死亡小鼠體內(nèi)分離出DB1和DB4，純化保存。選出培養(yǎng)特性、生化特性穩(wěn)定且致病

3、性強(qiáng)的DB4菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　2.細(xì)菌毒力試驗(yàn)測得ZYD2 LD50為1×1010.63 CFU，YB2 LD50為1×102.309 CFU;將DB4作為疫苗菌株，制成含菌量109 CFU/mL、1010CFU/mL的蜂膠佐劑滅活疫苗;高劑量接種試驗(yàn)鴨后觀察14 d，無異常，表明疫苗安全可靠;再次將兩個濃度疫苗分組免疫鴨，14d后分別用10倍LD50 ZYD2和10倍LD50 YB2攻毒，兩個濃度組對ZYD2的保護(hù)率分別為

4、40％、80％，對YB2的保護(hù)率分別為50％、80％，說明疫苗濃度在1×1010 CFU/mL以上能起到較好的保護(hù)作用。
　　3.本試驗(yàn)分別以5.15μg/mL蛋白質(zhì)濃度的ZYD2菌體裂解物和8.02μg/mL蛋白質(zhì)濃度的YB2菌體裂解物為包被抗原，血清以2倍系列稀釋至1∶212，酶標(biāo)羊抗鴨IgG的工作濃度0.25μg/mL，使用間接ELISA方法檢測兩親本抗體效價(jià)。對其他不同抗原陽性血清交叉反應(yīng)及經(jīng)抗原處理阻斷試驗(yàn)結(jié)果為陰性。<

5、br>　　4.通過DB4疫苗接種鴨，對不同組血清抗體水平和淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞及細(xì)胞因子含量變化進(jìn)行檢測，對DB4疫苗的免疫原性進(jìn)行評價(jià):
　　(1)間接ELISA方法檢測免疫鴨的血清抗體效價(jià)水平。ZYD2抗體效價(jià)變化趨勢:免疫后一免組抗體效價(jià)升至1∶27.5后逐漸降低至對照組水平，二免組繼續(xù)上升，最后保持在1∶29以上。YB2變化趨勢:一免組先上升，后降至空白對照組水平，二免組血清抗體效價(jià)持續(xù)升高至1∶28，最終保持在1∶27?？瞻?/p>

6、對照組免疫免疫前后后變化不明顯。
　　(2)用CCK-8試劑盒檢測鴨外周血淋巴細(xì)胞體外增殖活性。分離外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，Con A和親本抗原均能刺激淋巴細(xì)胞提高其增殖活性，免疫組的增殖能力明顯高于對照組(P＜0.05)，二免組與空白對照組差異極其顯著(P＜0.01)，與一免組差異顯著(P＜0.05)。DB4疫苗可刺激鴨淋巴細(xì)胞，使其增殖活性提高，免疫兩次作用更明顯。
　　(3)ELISA試劑盒檢測鴨免疫后0d、3d、

7、7d、11d、15d、20 d、25 d的外周血血清中IL-4和IFN-γ的濃度。免疫后血清中IL-4濃度和IFN-γ濃度均上升，但各組差異較大(P＜0.05）;一免組上升速度平緩，二免組在免疫后25 d開始快速上升，與對照組和一免組差異極其顯著(P＜0.01);空白對照組與免疫前變化不明顯。
　　(4)免疫后0d、7d、15d、25 d白細(xì)胞吞噬率(PP)和吞噬指數(shù)(PI)均隨日齡的增加呈上升趨勢，免疫組上升速度遠(yuǎn)大于空白對照組