雞致病性大腸桿菌基因工程菌株的構(gòu)建及其免疫原性的研究.pdf

1、雞大腸桿菌病是一種由大腸埃希氏菌為原發(fā)性或繼發(fā)性病原體所致雞的一類疾病的總稱。十二世紀(jì)中期以后，隨著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，雞大腸桿菌病的危害日趨嚴(yán)重，特別是在雞的幾種重要病毒病得到有效控制后，由其造成的損失明顯上升，該病已成為危害養(yǎng)雞業(yè)的主要細(xì)菌病之一。 本文分別對本實驗室保存的四株雞致病性大腸桿菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定以及藥敏實驗、毒力實驗的研究，又將此四株菌株按照適當(dāng)?shù)谋壤苽淞舜竽c桿菌多價滅活疫苗，所制菌苗產(chǎn)生免疫力較早，免疫

2、保護(hù)期較長，具有較好的免疫原性。然后，以這四株菌株為研究對象，根據(jù)GenBank公布的致病性雞大腸桿菌的I型菌毛pilA基因和外膜蛋白C基因序列，分別設(shè)計了兩對引物，經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增出pilA基因和OmpC基因，序列分析表明擴(kuò)增得到的基因與其參考菌株序列高度同源。進(jìn)而，將擴(kuò)增得到的兩個基因分別定向克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中，得到兩個重組質(zhì)粒pETpilA和pETOmpC，轉(zhuǎn)化致受體大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌株BL

3、21(DE3)(pETpilA)和BL21(DE3)(pETOmpC)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，由SDS-PAGE分析分別可見表達(dá)的20Ku和40.9Ku的特異蛋白條帶；Westemblot檢測說明表達(dá)的a毒素蛋白具有較好的反應(yīng)原性。又對已構(gòu)建的基因工程菌株BL21(DE3)(pET-pilA)和BL21(DE3)(pET-OmpC)，分別從溫度、接菌量、誘導(dǎo)時機(jī)、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間等方面進(jìn)行誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，結(jié)果顯示菌株BL21(DE3)

4、(pET-pilA)在40℃，接菌量80ul，誘導(dǎo)時機(jī)2.5h，IPTG濃度為0.96mM，誘導(dǎo)時間6h時得到最大蛋白表達(dá)量，而菌株BL21(DE3)(pET-OmpC)的最佳誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)溫度37℃，接菌量60ul，誘導(dǎo)時機(jī)2h，IPTG濃度為0.80mM，誘導(dǎo)時間5h。最后，將表達(dá)菌毛pilA蛋白和外膜蛋白C的菌株分別制成基因工程疫苗并進(jìn)行初步的免疫原性研究，免疫小鼠后，保護(hù)能力分別達(dá)80％和60％，混合疫苗的保護(hù)力尤佳，高達(dá)100