布魯氏菌新型疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、該研究所選的L7/L12核蛋白為公認的T細胞保護性抗原,它具有高度的保守性,研究發(fā)現(xiàn),重組L7/L12蛋白能特異性地刺激感染動物的單核細胞,并上調(diào)INF-γ的轉(zhuǎn)錄和表達,從而起到保護作用.以其為基礎(chǔ)構(gòu)建的重組蛋白苗和DNA疫苗都表現(xiàn)了較好的免疫保護效果;而OMP16外膜脂蛋白存在于所有6種布魯氏菌中,也有一定的免疫保護作用;17.3kDa蛋白與布魯氏菌18kDa的外膜蛋白(優(yōu)秀的保護性抗原)的AA序列相似,因此,我們通過實驗來驗證17.

2、3kDa蛋白是否具有保護作用.對翻譯起始因子3蛋白進行抗原預(yù)測表明其具有免疫原性.該課題以4種蛋白分子為研究對象,分別構(gòu)建了真核,原核表達質(zhì)粒并表達了這4種蛋白,免疫動物后,研究其誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答.從布魯氏菌中提取其全基因組DNA,利用PCR技術(shù)擴增出4種蛋白的編碼基因,測序正確后分別克隆至原核表達載體PET32a(+)上,經(jīng)誘導(dǎo)表達出相應(yīng)的4種重組蛋白,WB鑒定后純化待用;同時,4種編碼基因隆至真核表達載體PCDNA3

3、.1(+)上,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞后經(jīng)WB證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.將重組蛋白混合弗氏佐劑免疫動物,同時DNA疫苗以PUMVC1-mGM-CSF重組質(zhì)粒為佐劑(各100μg/只)肌肉免疫動物;每15d免疫一次,加強免疫三次后檢測免疫應(yīng)答指標,并進行組間比較.ELISA法檢測到較高滴度的特異性抗體,WB也證實特異性抗體的產(chǎn)生;抗體亞型分類表明重組蛋白組的特異性IgG1/IgG2a大于1,而DNA疫苗免疫組卻小于1,說明重組蛋白疫苗誘導(dǎo)

4、產(chǎn)生了Th2型為主免疫應(yīng)答,DNA疫苗產(chǎn)生了Th1型為主的免疫應(yīng)答.MTS法測小鼠T淋巴細胞增殖試驗發(fā)現(xiàn)DNA組小鼠脾臟T淋巴細胞對ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)增強,而重組蛋白組卻無顯著變化.進一步通過ELISPOT方法檢測特異性活化的可分泌IFN-γ的CD8+T細胞數(shù),DNA免疫組的斑點數(shù)顯著多于對照組(P<0.05);說明誘導(dǎo)了特異性CD8+T淋巴細胞應(yīng)答.流式細胞儀所得到的淋巴細胞亞群分類也得到了同樣的結(jié)果.本課題利用真核表達載體PCD

5、NA3.1成功構(gòu)建了含4種布魯氏菌編碼蛋白的重組質(zhì)粒,并利用原核表達載體表達了相應(yīng)的重組蛋白.通過ELISA、WB、ELISPOT及淋巴細胞亞群分類檢測疫苗在免疫小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液及細胞免疫指標.該研究成功構(gòu)建了布魯氏菌基因工程疫苗,在國內(nèi)尚屬首次,利用流式細胞儀的分型技術(shù)和ELISPOT法評價布魯氏菌疫苗的細胞免疫指標將促進中國獸用疫苗及相關(guān)產(chǎn)品的實驗室質(zhì)控標準方法的建立和發(fā)展,為他們的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).進一步的攻毒實驗尚在進行中