惡性瘧原蟲融合蛋白PfCP-5的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、瘧疾目前仍是一種危害嚴(yán)重的蟲媒傳染病。全球每年約有3—5億瘧疾病例，其中約300萬病人死于惡性瘧，大多為五歲以下的兒童。隨著瘧原蟲對抗瘧藥物以及蚊媒對殺蟲劑抗性的產(chǎn)生和擴(kuò)散，瘧疾防治面臨很大的困難，因此研究和開發(fā)有效的瘧疾疫苗已成為防治瘧疾潛在的新的途徑。 瘧原蟲子孢子通過瘧蚊叮咬進(jìn)入人體后，并侵入肝細(xì)胞發(fā)育繁殖，產(chǎn)生裂殖子釋放入血，并侵入紅細(xì)胞生長繁殖。阻斷瘧原蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞是抑制紅內(nèi)期原蟲生長的重要環(huán)節(jié)，也是紅內(nèi)期疫苗的

2、主要靶點。研究表明，裂殖子入侵紅細(xì)胞是由受體和配體介導(dǎo)，位于裂殖子表面的蛋白可能參與該入侵過程，是疫苗研究潛在的靶抗原。本研究旨在研究惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白(MerozoiteSurface Protein MSP)3、4和5的免疫保護(hù)功能。MSP3是裂殖子的一個外分泌蛋白，其免疫作用是通過ADCI機(jī)制抑制瘧原蟲生長。研究表明該蛋白的免疫保護(hù)功能位于氨基酸第184-210(MSP3b)，203-230(MSP3c)和211-252位(

3、MSP3d)，每個區(qū)域至少含有一個B細(xì)胞和一個T細(xì)胞表位，抗MSP3b的抗體通過ADCI效應(yīng)機(jī)制在體外有效殺滅瘧原蟲?？筂SP3c和MSP3d抗體在體外有較強(qiáng)的ADCI作用，抑制原蟲生長。因此MSP3第184-252位的69個氨基酸殘基片段是其保護(hù)性免疫的功能片段。MSP4是通過GPI位于裂殖子表面的蛋白質(zhì)，其C末端含有EGF樣結(jié)構(gòu)域。MSP5與MSP4高度同源，并在其C末端含有EGF樣結(jié)構(gòu)域。針對這兩個蛋白EGF區(qū)域的抗體在體外能部分

4、抑制瘧原蟲生長。 本研究將上述3個裂殖子表面蛋白的功能區(qū)域，即MSP4 C-末端EGF區(qū)域(MSP4D，第204-248位氨基酸片段)、MSP3的69個氨基酸片段和MSP5 C-末端EGF區(qū)域(MSP5D,第208-251位氨基酸片段)融合組成一個融合抗原，定名為惡性瘧原蟲融合蛋白5(Plasmodium falciparum Chimeric Protein 5，PfCP-5)。從GenBank獲得3D7株惡性瘧原蟲各片段的序

5、列，并按以下次序排：MSP4D-MSP3-69-MSP5D。按照畢氏酵母密碼子使用頻率對PfCP-5基因序列進(jìn)行重新設(shè)計，并將第86位的N→Q排除一個糖基化位點。在基因的兩端加上合適的酶切位點XhoI/EcoRI，以及在3'端加上6個His的TAG以便后續(xù)蛋白的純化。人工全合成PfCP-5基因。將合成基因插入過渡載體pPIC9，從而將目的基因前端加上分泌表達(dá)的信號肽序列，進(jìn)而轉(zhuǎn)到表達(dá)載體pPIC9K，酶切線性化后電轉(zhuǎn)畢氏酵母。挑取經(jīng)G4

6、18篩選的克隆進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。Western blotting鑒定目的蛋白的表達(dá)。采用15升罐進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，用Ni-NTA親和純化，獲得較高純度的目的蛋白用于后續(xù)的動物免疫實驗。此外，為純化MSP3特異的抗體，我們在大腸桿菌中表達(dá)了GST-MSP3-69融合蛋白，并分離純化了該蛋白。動物免疫實驗分為ISA720佐劑組、弗氏佐劑組、氫氧化鋁/CpG1826聯(lián)合佐劑組、ISA70MVG佐劑組和ISA206佐劑組。純化的PfCP-5蛋白與佐

7、劑乳化后免疫6—8周齡的雌性BALB/c小鼠，每個蛋白佐劑組6只，相應(yīng)的PBS佐劑對照6只，每只每次免疫20μg蛋白，免疫體積為10μl，皮下注射免疫三次，間隔兩周，每次免疫后第8天尾靜脈取血。免疫血清用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測免疫血清的特異抗體滴度，并進(jìn)行抗體亞型的分析。結(jié)果表明：血清抗體滴度在1/200,000—1/765000范圍，其中氫氧化鋁/CpG聯(lián)合佐劑組抗體滴度最高為1/76.5×10<'4>，其次是弗氏佐劑組抗

8、體滴度為1/55.2×10<'4>，再次ISA720佐劑組抗體滴度為1/48.9×10<'4>，ISA70MVG和ISA 206組最低，滴度分別在1/25.3×10<'4>和1/20.9×10<'4>。氫氧化鋁/CpG聯(lián)合佐劑組，弗氏佐劑組和ISA720佐劑組三組抗體滴度之間沒有差異(p>0.05)，但是三個佐劑組依次分別是ISA70MVG組的3.0倍，2.18倍和1.93倍，同時，分別是206佐劑組的3.66倍，2.64倍和2.33倍

9、。為檢測免疫血清能否識別瘧原蟲天然蛋白，我們以體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲為抗原，采用間接免疫熒光抗體試驗(IFA)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，PfCP-5抗體能與瘧原蟲天然蛋白反應(yīng)。IFA結(jié)果顯示：氫氧化鋁/CpG聯(lián)合佐劑組、ISA720佐劑組、弗氏佐劑組、ISA70MVG佐劑組和ISA206佐劑組在同是1∶100稀釋時，氫氧化鋁/CpG聯(lián)合佐劑組、ISA720佐劑組、弗氏佐劑組陽性較強(qiáng)，而ISA70MVG佐劑組和ISA206佐劑組陽性較弱?？贵w亞型

10、分析結(jié)果顯示，IgG1抗體滴度最高達(dá)1/10<'6>，IgG2a為其次，最后是IgG2b及IgG3，分別為1/1.2×10<'4>和1/0.9×10<'4>。 采用新西蘭白兔為接種動物，實驗分為ISA720佐劑組、弗氏佐劑組及氫氧化鋁/CpG(CpG2007)聯(lián)合佐劑組。每組家兔3只，每只每次皮下注射100ug蛋白，注射體積為1ml，間隔三周，免疫三次，每次免疫后第8天取血，ELISA檢測血清抗體滴度結(jié)果顯示：其中ISA720佐

11、劑組最高滴度達(dá)1/102×10<'4>，弗氏佐劑組在1/72.7×10<'4>，氫氧化鋁與CpG聯(lián)合免疫組1/25.2×10<'4>，三者之間比較存在顯著差異(p<0.01)。此外，用大腸桿菌表達(dá)GST-MSP3-69融合蛋白，經(jīng)與ISA720佐劑、弗氏佐劑、氫氧化鋁/CpG(CpG1826)聯(lián)合佐劑分別乳化后免疫BALB/c小鼠。三次免疫后血清ELISA檢測抗體滴度分別為1/138×10<'4>，1/116×10<'4>和1/72.5

12、×10<'4>。用惡性瘧原蟲FCC1/HN株進(jìn)行體外抑制試驗，結(jié)果表明抗PfCP-5的免疫血清沒有明顯抑制瘧原蟲生長的作用。用純化的PfCP-5和GST-MSP3-69為抗原，制備Sepherose 4B-PfCP-5和Sepherose 4B-GST-MSP3-69親和柱進(jìn)行特異抗體的分離。用親和純化的特異抗體進(jìn)行體外抑制試驗，結(jié)果表明在純化兔抗IgG在終濃度為1.25mg/ml時沒有明顯抑制原蟲生長作用。然而，在單核細(xì)胞存在的情況下

13、，抗PfCP-5 IgG終濃度為1.25mg/ml時，抗PfCP-5IgG和抗GST-MSP3-69 IgG抑制率分別在68％和51.5％。 綜上所述：本研究構(gòu)建了PfCP-5融合基因并在畢氏酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生融合蛋白PfCP-5；構(gòu)建并表達(dá)了MSP3(184-252)片段和GST-MSP3-69融合抗原。動物免疫實驗表明，這些抗原具有較強(qiáng)的免疫原性，對不同佐劑免疫實驗表明在小鼠體內(nèi)氫氧化鋁/CpG (CpG2007)聯(lián)合佐

14、劑能誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。不同佐劑組免疫小鼠血清均能識別體外培養(yǎng)的瘧原蟲，表明誘導(dǎo)產(chǎn)生針對天然構(gòu)象表位的抗體。在沒有單核細(xì)胞存在情況下，抗PfCP-5特異IgG和抗GST-MSP3-69特異IgG沒有明顯抑制瘧原蟲生長的作用，但在單核細(xì)胞存在的情況下，抑制率分別在68％和51.5％。本試驗為后續(xù)實驗純化瘧疾流行區(qū)針對PfCP-5人抗IgG進(jìn)行該蛋白的功能評價及將PfCP-5或MSP3-69插入本實驗室已經(jīng)構(gòu)建的瘧疾候選疫苗PfCP-2