溶藻弧菌主要外膜蛋白的免疫原性及其基因克隆.pdf

1、本文通過超速離心的方法從溶藻弧菌中提取外膜蛋白(Outer membraneproteins，Omp)，經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)G-250染色后，顯示四條清晰的蛋白條帶，其分子量分別為35.6kD、39.3kD、43．1kD、47.8kD。 用Western Blot印跡檢測(cè)溶藻弧菌Omp與兔抗溶藻弧菌血清免疫反應(yīng)，兔抗溶藻弧菌血清與溶藻弧菌Omp有一條主要的免疫反應(yīng)帶，其分子量為35.6kD，同時(shí)還有兩條微弱的顯色帶

2、，其分子量分別為39.3kD和47.8kD。結(jié)果表明，35.6kD Omp具有較強(qiáng)的免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答，因而，初步認(rèn)為35.6kD外膜蛋白是溶藻弧茵的主要外膜蛋白(Major Outer membrane protein，MOmp)。 溶藻弧菌的MOmp通過切膠回收，離心后冷凍干燥獲得了35.6kD Omp的純品，并用透析法制備了免疫刺激復(fù)合物亞單位疫苗(ISCOM-MOmp)，對(duì)紅鰭笛鯛(Lutjnussa

3、nguineus)進(jìn)行免疫接種，用免疫擴(kuò)散法測(cè)得在第5周時(shí)的血清效價(jià)為1：16，持續(xù)一段時(shí)間后再緩慢下降。第10周用9.3×10<'8>cfu／mL溶藻弧菌活菌腹腔攻毒，其免疫保護(hù)率為71.4％，對(duì)照組的存活率僅為6.7％。因而認(rèn)為所得的35.6kD的外膜蛋白為溶藻弧菌的主要保護(hù)性抗原。切膠回收的Omp用Western Blot印跡檢測(cè)仍有清晰的反應(yīng)條帶，說明回收后它仍存在抗原活性。 35.6kD MOmp經(jīng)過SDS-PAGE后

4、轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用PROCISE cLC蛋白測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行N末端氨基酸序列分析，測(cè)得27個(gè)氨基酸，結(jié)果為ATVYK DGGTE LLVGGRVEFRGDFIG SD。 利用限制性內(nèi)切酶Sau3A I將溶藻弧菌染色體DNA進(jìn)行完全酶切后，與經(jīng)過BamHI酶切、脫磷酸后的pUCl8連接重組，感染受體菌E.coli DH5α，構(gòu)建溶藻弧菌的部分基岡文庫(kù)。獲得了500個(gè)白斑菌落。 根據(jù)所得MOmp N端氨基酸序列，設(shè)計(jì)了兩條寡

5、核苷酸探針，探針I(yè)為5’-----GCAACA(C)GTTTAT(C)AAAGAT(C)GGT(C)GGC(T)ACTGAGCTACTAGTTGGC(T)GGT(G)CGCGTT-----3’；探針Ⅱ?yàn)?’----CTACTAGTTGGC(T)GGT(G)CGCGTTGAGTTT(C)CGT GGC(T)GAC(T)TTCATC(T)GGTTCAGAT(C)-----3’。地高辛標(biāo)記后與500個(gè)白斑菌落原位雜交篩選重組菌落。第2條探針與