禽呼腸孤病毒σC基因的克隆表達(dá)及其免疫原性初步研究.pdf

1、雞病毒性關(guān)節(jié)炎是近年來發(fā)現(xiàn)的一種由禽呼腸孤病毒(AvianReovirusvirus，ARV)引起的雞慢性傳染病，以侵害跗關(guān)節(jié)、趾關(guān)節(jié)及其肌腱和心肌為特征。該病在世界各地均有發(fā)生，對養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。ARVσC蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，具有免疫效果好的特點。本試驗應(yīng)用基因克隆技術(shù)進(jìn)行體外表達(dá)σc蛋白并對其進(jìn)行免疫原性的初步研究。 試驗采用RT-PCR技術(shù)設(shè)計擴(kuò)增禽呼腸孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因，將擴(kuò)

2、增基因克隆至pMD-19T載體上，構(gòu)建了pMD19T-σC克隆載體，經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定，克隆的基因片段大小為1038bp，擴(kuò)增的目的片段與報道的S1133σC基因的核苷酸序列同源性為98％。將該基因重組至pET32a(+)原核表達(dá)載體上成功構(gòu)建了表達(dá)載體pET32a-σC，該重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中經(jīng)1.0mMIPTG誘導(dǎo)5小時得到最佳表達(dá)。表達(dá)重組蛋白的相對分子質(zhì)量為54KDa，以包涵體形式存在。經(jīng)Western-blot分

3、析表明，該重組蛋白能于ARV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。 pET32a-σC重組菌大量誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物用低壓液相層析儀進(jìn)行組氨酸標(biāo)簽的過柱純化，在100mM咪唑buffer洗脫時蛋白較純，純化的蛋白經(jīng)復(fù)性后測得其蛋白含量為150μg/ml。試驗動物分為三組，分別為S1133滅活苗組，σC蛋白免疫組和空白對照組，在13、20和35日齡分別采集血清用建立的σC-ELISA方法進(jìn)行抗體的檢測分析，在36日