草魚呼腸孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的功能及免疫原性分析.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國淡水主要養(yǎng)殖品種,是“四大家魚”之一。其飼養(yǎng)成本低,養(yǎng)殖范圍廣,但養(yǎng)殖過程病害較多,其中草魚出血病可引起草魚大批死亡,草魚種苗階段受感染的死亡率高達90％,給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來了巨大的損失。引起草魚病毒性出血病的病毒為草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus，GCRV),隸屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)、水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus，AQRV)

2、。根據(jù)本實驗室已獲得的草魚呼腸孤病毒廣東株 GCRV-GD108株全序列,本研究對其編碼 VP5蛋白的M5基因序列進行了分析,同時構(gòu)建其原核表達載體,制備重組 VP5蛋白,檢測了其 NTPase(核苷三磷酸酶,nucleoside triphosphatases)活性,并對其免疫原性進行了初步研究。
　　1.草魚呼腸孤病毒GCRV-GD108株M5基因序列分析
　　GCRV-GD108的M5基因全長2230bp,含一個開放閱

3、讀框(ORF)2178bp。Blast結(jié)果顯示M5基因編碼分子量大小約80ku的蛋白。氨基酸序列分析表明,該蛋白與水生呼腸孤病毒屬中多個病毒株的核衣殼蛋白VP5的氨基酸同源性為24%-25%;與哺乳動物正呼腸孤病毒(Mammalian reovirus,MRV)的μ2及禽呼腸孤病毒(Avian reovirus,ARV)的MμA也有較高的同源性(20%)。且該蛋白包含一段μ2樣NTP結(jié)合保守區(qū)域,因此可確定GCRV-GD108株M5基因

4、編碼的蛋白為VP5,與MRV的μ2和ARV的μA蛋白同源。
　　2. GCRV-GD108株M5基因原核表達載體的構(gòu)建及表達
　　以根據(jù)已獲得的M5基因 cDNA序列,分別設(shè)計合成帶特定酶切位點的特異引物,進行 PCR擴增;通過酶切與連接,構(gòu)建了兩種重組表達載體 pET30c-M5和pColdⅡ-M5,分別轉(zhuǎn)化于大腸桿菌并進行誘導(dǎo)表達;對培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑濃度和溫度等條件進行優(yōu)化,確定最適表達體系。SDS-PAGE和W

5、estern Blot對表達產(chǎn)物進行鑒定。結(jié)果顯示所構(gòu)建的兩種 VP5蛋白原核表達載體,均在大腸桿菌中成功地表達了分子量大小與預(yù)期相符(約為80 ku)的重組蛋白,且表達產(chǎn)物主要存在于包涵體中。誘導(dǎo)表達后的菌體經(jīng)離心、洗滌與超聲破碎,離心收集包涵體。包涵體通過變性、透析與復(fù)性,獲得純化的重組蛋白,其中pET30c-M5/BL21(DE3)工程菌的目的蛋白占全菌蛋白的22.5%,純化后獲得了高純度的重組蛋白(>95%)。比較兩種表達載體的

6、表達結(jié)果,認為表達載體pET30c-M5具有誘導(dǎo)表達耗時少、獲得重組蛋白量大的優(yōu)勢,可為下一步的研究提供足量的蛋白。
　　3.重組 GCRV-GD108株 VP5蛋白 NTPase活性及免疫原性分析
　　重組蛋白經(jīng)純化后,進行 ATPase活性測定,通過鉬酸銨比色法分析顯示重組 VP5蛋白具有一定的ATPase活性,活力為0.693μmolPi/mgprot/hour。同時用重組蛋白免疫草魚,采用熒光定量 PCR方法分析誘導(dǎo)