雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白可溶性原核表達(dá)、純化及免疫原性分析.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的3到12周齡雛雞和青年雞的一種急性、高度接觸性傳染病。IBDV主要侵害法氏囊B淋巴細(xì)胞而引起患病雞的免疫抑制，給養(yǎng)禽業(yè)造成很大的的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于VP2蛋白是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和宿主保護(hù)性抗原，也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)基因。本試驗(yàn)構(gòu)建了7個(gè)帶有不同標(biāo)簽的VP2-LS

2、3(lumazine synthase,LS3)重組原核表達(dá)載體，以期在大腸桿菌中表達(dá)出高可溶性的VP2-LS3重組蛋白。檢測(cè)結(jié)果顯示表達(dá)的VP2-LS3重組蛋白具有良好的免疫原性，鏡檢顯示形成了LS3蛋白籠。本試驗(yàn)為IBDV基因工程亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
　　首先，本試驗(yàn)對(duì)7種融合標(biāo)簽的基因序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)Nde I和Bam HI兩個(gè)酶切位點(diǎn)用于擴(kuò)增7種融合標(biāo)簽的核苷酸序列(His6-Grifin-TEV、His6-GST

3、-TEV、His6-MBP-TEV、His6-NusA-TEV His6-γ-crystallin-TEV、His6-ArsC-TEV和His6-PpiB-TEV)。將7種標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)菌液PCR及測(cè)序分析鑒定正確后，把正確的7種標(biāo)簽的線性片段和VP2-LS3目的基因與表達(dá)載體pET-21b連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后跑S

4、DS-PAGE電泳分析融合不同標(biāo)簽的VP2-LS3蛋白的表達(dá)量和可溶性。篩選出對(duì)VP2-LS3蛋白可溶性表達(dá)水平較高的融合標(biāo)簽，并進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示：除了PpiB標(biāo)簽，其它標(biāo)簽都不同程度地促進(jìn)了VP2-LS3蛋白的可溶性表達(dá)，其中MBP標(biāo)簽效果最好，可溶性表達(dá)水平達(dá)到69.5％。
　　其次，利用Ni-NTA Agarose親和純化VP2-LS3重組蛋白并用TEV酶酶切獲取VP2-LS3蛋白。電鏡觀察分析VP2-LS3重組蛋

5、白是否形成蛋白籠納米顆粒。試驗(yàn)結(jié)果顯示TEV酶可以把His6-MBP標(biāo)簽蛋白與VP2-LS3蛋白分開，獲得了高純度的VP2-LS3蛋白；鏡檢顯示形成了LS3蛋白籠納米顆粒。
　　最后，將純化的VP2-LS3重組蛋白與等體積的佐劑乳化，制備基因工程亞單位疫苗免疫家兔，獲得兔抗VP2的血清，并對(duì)其進(jìn)行Western blot和間接ELISA分析。Western blot分析結(jié)果表明表達(dá)的VP2蛋白可與IBDV陽性血清發(fā)生反應(yīng)，而不與陰