傳染性法氏囊病病毒多聚蛋白在家蠶中的表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、以該實(shí)驗(yàn)組已克隆的IBDV JD1株(細(xì)胞弱化株)基因組A節(jié)段為模板,用PCR分別擴(kuò)增出多聚蛋白(VP2/4/3)的cDNA和VP2蛋白的cDNA,將兩者分別克隆入基于家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-8的多角體蛋白啟動(dòng)子下游,重組載體與人工突變型桿狀病毒Bm-BacPAK6的線性化基因組DNA共轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞(BmN)后,經(jīng)過數(shù)輪挑斑純化和擴(kuò)增,獲得不含親代病毒Bm-BacPAK6的重組桿狀病毒(rBV)Ba

2、cPAK-A和BacPAK-VP2.重組桿狀病毒感染BmN細(xì)胞至其出現(xiàn)細(xì)胞病變后,提取細(xì)胞總DNA,用DIG標(biāo)記的IBDV特異性探針作點(diǎn)雜交可檢測(cè)到陽性雜交信號(hào);提取經(jīng)過BmN細(xì)胞連續(xù)傳代15次的重組桿狀病毒BacPAK-A的感染細(xì)胞總DNA作PCR和Southern分析,均出現(xiàn)了特異性條帶,說明IBDV多聚蛋白基因和VP2基因已通過同源重組插入桿狀病毒Bm-BacPAK6的基因組中,且BacPAK-A至少在體外傳代15次以內(nèi)是穩(wěn)定的.

3、重組桿狀病毒通過血淋巴腔注射的方式感染5齡起家蠶幼蟲進(jìn)行蠶體內(nèi)表達(dá),從感染后3天家蠶有明顯發(fā)病癥狀開始每天隨機(jī)取蠶血淋巴凍存?zhèn)溆?到感染后6天,大部分家蠶已至瀕死狀態(tài).用ELISA、SDS PAGE和Western blotting等方法檢測(cè)收集的家蠶血淋巴,結(jié)果表明IBDV多聚蛋白基因和VP2基因在蠶體內(nèi)得到表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物具有免疫反應(yīng)性,表達(dá)量在感染后5-6天達(dá)最高水平.用感染后第5天的家蠶血淋巴作抗原制備礦物油乳劑苗,進(jìn)行了該疫苗的

4、安全性試驗(yàn)和3免疫-攻毒試驗(yàn).在安全性試驗(yàn)中,以皮下注射途徑接種1倍和5倍免疫劑量的14日齡雛雞均未出現(xiàn)臨床反應(yīng),撲殺后亦未見剖檢變化.在免疫-攻毒試驗(yàn)中對(duì)非免疫雛雞進(jìn)行14日齡首免和28日齡加強(qiáng)免疫,同時(shí)設(shè)IBDV商品疫苗D78作為免疫效果對(duì)照,免疫后定期采血作抗體檢測(cè).加強(qiáng)免疫25天后用IBDV強(qiáng)毒(BC6/85株)攻擊,攻毒后第5天撲殺并剖檢,眼觀病變、囊體比值、組織切片病理學(xué)觀察和血清學(xué)試驗(yàn)表明,重組IBDV多聚蛋白疫苗與重組I

5、BDVVP2蛋白疫苗相比,能更有效地抵抗IBDV強(qiáng)毒(BC6/85株)的攻擊,對(duì)試驗(yàn)雞的臨床保護(hù)率(80％/73％)和病理保護(hù)率(80％/53％)均高于后者,其誘導(dǎo)的IBDV中和抗體水平亦明顯高于后者(GMT 9769/4088);多聚蛋白疫苗與商品化疫苗D78相比,誘導(dǎo)IBDV中和抗體升至最高水平的速度較慢(加強(qiáng)免疫后25天/18天),但后者誘導(dǎo)抗體的持續(xù)時(shí)間短,且造成的法氏囊病變比多聚蛋白嚴(yán)重(法氏囊病變等級(jí):2+++/1+,2++

6、).因此我們認(rèn)為,IBDV多聚蛋白是比VP2蛋白更適于作為免疫原的病毒成分.在完成全部實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,向農(nóng)業(yè)部遞交了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物中間試驗(yàn)報(bào)告書(項(xiàng)目名稱:用蠶表達(dá)的雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)新型疫苗在浙江省的中間試驗(yàn)),得到批復(fù)后,用含重組IBDV多聚蛋白的家蠶血淋巴制備礦物油佐劑疫苗,在浙江省桐廬縣一生態(tài)禽養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)300羽非免疫雛雞進(jìn)行9日齡首免和23日齡加強(qiáng)免疫,免疫后雞群生長(zhǎng)良好,未發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng),也無IBD的發(fā)生;

7、血清ELISA試驗(yàn)表明免疫后有高滴度IBDV抗體的產(chǎn)生.與此同時(shí),按農(nóng)業(yè)部要求進(jìn)行了重組桿狀病毒的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)和含重組多聚蛋白的家蠶血淋巴的急性毒性試驗(yàn),結(jié)果表明,重組桿狀病毒至少在100次體外傳代中是穩(wěn)定的;作為疫苗抗原成分的家蠶血淋巴對(duì)小鼠無急性毒性.該研究首次利用桿狀病毒-家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)了IBDV多聚蛋白,并對(duì)同一系統(tǒng)表達(dá)的IBDV VP2蛋白進(jìn)行了免疫效果的比較.雖然研究表明在該系統(tǒng)中VP2的表達(dá)量明顯高于多聚蛋白的表達(dá)量