朊病毒病核酸疫苗免疫原性的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：（1）構(gòu)建定位于溶酶體、泛素的PrP表達(dá)載體，并進(jìn)行蛋白表達(dá)特點及定位的鑒定；（2）動物免疫后，初步研究此融合表達(dá)載體在小鼠體內(nèi)激起的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，得到一組最基礎(chǔ)的免疫數(shù)據(jù)，為以后朊蛋白疫苗的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 方法：（1）將泛素基因、溶酶體膜定位信號序列基因和PrP基因連接，克隆至pcDNA3．1載體中，構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3．1-UPrP、pcDNA3．1-PrPL；瞬時轉(zhuǎn)染真核表達(dá)細(xì)胞，經(jīng)Wester

2、n Blot和間接免疫熒光技術(shù)檢測PrP表達(dá)特點；（2）小鼠分八組，其中四組小鼠按0、14、28天分三次分別用質(zhì)粒pcDNA3．1、pcDNA3．1-HuPrP、pcDNA3．1-UbPrP、pcDNA3．1-PrPL免疫；另四組小鼠中，有一組按0、14、28天分三次免疫重組PrP，另三組分別用質(zhì)粒pcDNA3．1-HuPrP、pcDNA3．1-UbPrP、pcDNA3．1-PrPLⅡ首次免疫，PrP蛋白加強(qiáng)兩次。最后一次免疫后2周，取

3、脾臟及血液進(jìn)行ELISPOT、ELISA、WesternBlot檢測。 結(jié)果：（1）構(gòu)建的各種PrP定位表達(dá)載體均可定位表達(dá)具有三種類型的糖基化分子的PrP，以雙糖基化分子類型最多。帶有泛素、溶酶體信號尾的質(zhì)粒pcDNA3．1-UbPrP、pcDNA3．1-PrPLⅡ的PrP表達(dá)隨著時間的延長蛋白表達(dá)量下降，提示泛素、溶酶體信號能加速表達(dá)的PrP在細(xì)胞內(nèi)的降解。（2）動物免疫后，重組蛋白增強(qiáng)免疫的四組小鼠脾淋巴細(xì)胞在全長人PrP

4、的刺激下，UbPrP+rPrP組有兩只小鼠的脾淋巴細(xì)胞分泌特異性IFN-γ，分別為215、50SFCs/106/PBMCs；PrP+rPrP組中有一只小鼠為113．5 SFCs/106/PBMCs，PrPLⅡ+rPrP組和rPrP組的小鼠脾淋巴細(xì)胞不分泌特異性IFN-γ；在DNA核酸疫苗免疫的四組小鼠脾淋巴細(xì)胞中，儀UbPrP組的淋巴細(xì)胞兩只小鼠淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生明顯的斑點，分別為56、50SFCs/106/PBMC，其他組的脾淋巴細(xì)胞在重

5、組蛋白的刺激下均為陰性。小鼠抗血清ELISA結(jié)果顯示，重組蛋白組免疫小鼠的抗血清的滴度為1：51200，經(jīng)質(zhì)粒初免、重組蛋白增強(qiáng)小鼠抗血清效價在大于1：102400，明顯高于單純重組蛋白免疫組；UbPrP組及PrPLⅡ組質(zhì)粒免疫小鼠抗血清滴度大于1：400；未修飾PrP組及空載體pcDNA3．1組小鼠抗血清與免疫前血清的P/N值小于2．1。各組抗血清特異性檢測的WB結(jié)果顯示：各組免疫小鼠的抗血清均可特異性識別重組人PrP。 結(jié)論