肺炎球菌溶血素核酸疫苗的制備及共免疫原性研究.pdf

1、肺炎鏈球菌是引起肺炎、腦膜炎、中耳炎的主要致病菌，是引起世界范圍嬰幼兒、老年人、免疫缺陷個(gè)體感染的主要原因之一。由于新型抗生素研發(fā)的相對滯后及臨床上常出現(xiàn)抗生素運(yùn)用的不當(dāng)，該菌耐藥性菌株日益增多，因此疫苗對防治感染的作用越來越重要。目前針對肺炎鏈球菌的疫苗應(yīng)用較多的是第一代23價(jià)肺炎多糖疫苗和第二代7價(jià)肺炎多糖-蛋白偶聯(lián)疫苗，前者主要問題在于單純多糖是T細(xì)胞非依賴性抗原，對免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的2歲以下嬰幼兒以及老年人的保護(hù)性弱；而多糖蛋

2、白偶聯(lián)疫苗的莢膜多糖只有7種血清型，數(shù)量有限，對肺炎高發(fā)人群保護(hù)作用小，且生產(chǎn)成本高、不適合在發(fā)展中國家大量使用，并有可能引起臨床上流行肺炎球菌血清型的改變。新型核酸疫苗技術(shù)近年來引起了防治肺炎球菌疾病研究的重視，對于肺炎球菌核酸疫苗的研究在動(dòng)物中已得到開展，以誘導(dǎo)抵制不同蛋白抗原免疫應(yīng)答為目的的核酸疫苗已在疾病模型中顯示了它們的保護(hù)效果。然而，核酸疫苗目前要解決的主要問題是其誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答水平不足以滿足預(yù)防和治療性疫苗的要求，表

3、現(xiàn)為核酸疫苗對小動(dòng)物較免疫效果好，但對人類或靈長類動(dòng)物無效或者誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答太低缺乏免疫保護(hù)或治療作用。
　　 肺炎球菌溶血素(Pneumolysin，PN)是肺炎球菌產(chǎn)生的最主要毒素之一，是肺炎球菌產(chǎn)生的唯一能破壞宿主防御、補(bǔ)體和免疫應(yīng)答的毒力蛋白，所有不同血清型肺炎鏈球菌的PN分子構(gòu)造或抗原性相似，相互之間有交叉免疫保護(hù)作用，因而成為肺炎球菌核酸疫苗的理想候選基因之一。其鄰近羧基端的11個(gè)氨基酸序列為細(xì)胞毒性所必需，為保證疫

4、苗的安全性，本研究在構(gòu)建核酸疫苗時(shí)切去肺炎球菌溶血素基因羧基端33個(gè)核苷酸以去除其溶血活性，并采用體內(nèi)電轉(zhuǎn)染初免結(jié)合蛋白質(zhì)加強(qiáng)的免疫策略以增強(qiáng)核酸疫苗在小鼠和非人靈長類動(dòng)物體內(nèi)的免疫原性。
　　 根據(jù)Walker等1987年報(bào)道的肺炎球菌溶血素基因序列(GenBank accessionno.X52474)，設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)從肺炎球菌基因組DNA中擴(kuò)增出肺炎球菌溶血素全長基因(pn)和切去羧基端33個(gè)核苷酸的基因(pnd

5、)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、回收，將pn插入到pET-28a中構(gòu)建成pET-pn重組體，將pnd插入到pET-21a載體中，構(gòu)建成ET-pnd重組體，經(jīng)鑒定后將pET-pn轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌YM109(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，將pET-pnd轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過超聲波破菌，用固相Ni-NTA樹脂作親和吸附純化。經(jīng)SDS-PAGE、溶血活性測定和Western-blotting檢測證實(shí)，蛋白表達(dá)的產(chǎn)物相對分子

6、量為52KDa和50KDa，純化后的蛋白純度達(dá)到90％以上。PND蛋白完全喪失溶血活性，但抗原性不受影響，完好保留了原PN蛋白質(zhì)的抗原表位，可用作檢測試驗(yàn)和核酸疫苗加強(qiáng)免疫的蛋白質(zhì)抗原。
　　 再將pn和pnd基因插入到pVAX1載體中，構(gòu)建Pn和Pnd重組質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α宿主細(xì)胞，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和DNA測序分析鑒定正確后大量抽提質(zhì)粒DNA，并去除內(nèi)毒素，配制Pn和Pnd核酸疫苗。
　　 將構(gòu)

7、建好的核酸疫苗對小鼠和恒河猴進(jìn)行DNA免疫。8周齡雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分組，每組5只。對照組注射pVAX1空質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組小鼠每只兩側(cè)脛骨前肌內(nèi)注射10μg肺炎球菌Pn或Pnd核酸疫苗，注射后立即于注射部位用活體基因?qū)雰x進(jìn)行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染。每隔兩周免疫1次，共3次，為初免。第3次核酸疫苗免疫后2周，用各核酸疫苗相應(yīng)的純化PN或PND蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只小鼠腹腔注射50μg不加佐劑的抗原蛋白。在第3次DNA免疫和蛋白質(zhì)抗原加強(qiáng)免疫

8、后的第10天采血，分離血清作免疫印染或ELISA間接法檢測血清特異性抗體及其效價(jià)。結(jié)果顯示小鼠肌肉內(nèi)注射10微克核酸疫苗加電轉(zhuǎn)染能誘導(dǎo)出特異性抗體免疫應(yīng)答。采用相應(yīng)蛋白加強(qiáng)，小鼠血清特異性抗體的幾何平均滴度比加強(qiáng)前提高約4倍。4-6歲(4-5公斤)恒河猴隨機(jī)分為2組，每組2只，采用TwinInjector注射裝置，分別肌肉注射Pn和Pnd核酸疫苗0.5mg/只，每4周免疫1次，共3次，末次免疫14天后用相應(yīng)的PN或PND蛋白腹腔接種進(jìn)行

9、加強(qiáng)免疫(500μg/只)，在第3次免疫或蛋白加強(qiáng)后第10天分別采血，用ELISA間接法測其效價(jià)。結(jié)果顯示給恒河猴肌肉內(nèi)注射0.5mg核酸疫苗加電轉(zhuǎn)染能誘導(dǎo)出特異性抗體免疫應(yīng)答，采用相應(yīng)蛋白加強(qiáng)，恒河猴血清特異性抗體的幾何平均滴度比加強(qiáng)前提高了約4倍。因此，采用電轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合DNA初免-加強(qiáng)免疫的策略，能顯著增強(qiáng)肺炎球菌溶血素核酸疫苗在小鼠和恒河猴體內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答。
　　 通過本課題，在國內(nèi)首次制備成功適合發(fā)展中國家的第三代