RSV重組蛋白疫苗的制備及其免疫原性和保護(hù)性研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人高患病率和死亡率的重要原因。60年代研制的福爾馬林滅活的RSV(FFI-RSV)免疫幼兒后，不僅沒達(dá)到預(yù)防目的，反而使其自然感染RSV后病情加重，造成80％被免疫者住院，其中2例死亡。目前認(rèn)為FI-RSV疫苗導(dǎo)致的病情加劇與伴隨肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和IL-4、11,-5細(xì)胞因子升高的Th2型優(yōu)勢(shì)應(yīng)答、中和抗體水平不足、以及缺乏局部免疫等有關(guān)。WHO已將

2、RSV疫苗列為優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一，但由于疫苗導(dǎo)致的免疫病理學(xué)和安全性問題，目前仍無一例安全有效的疫苗被批準(zhǔn)上市。 大量研究發(fā)現(xiàn)RSV的G蛋白免疫小鼠后能誘導(dǎo)以IgGl為主的抗體和Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，但不能誘導(dǎo)IgG2a、Thl和MHCI限制性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，這種免疫的不平衡性與該類蛋白疫苗的副作用密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)：在誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的同時(shí)激活CD8+T細(xì)胞可以下調(diào)Th2型細(xì)胞因子，同時(shí)防止嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，可見CD8+T細(xì)胞

3、不僅在清除RSV，而且在下調(diào)Th2型細(xì)胞因子應(yīng)答和控制Th2型優(yōu)勢(shì)應(yīng)答導(dǎo)致的病理反應(yīng)中均起著重要的作用。 一個(gè)理想的、安全有效的RSV疫苗應(yīng)該能夠同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫(抗體)、細(xì)胞免疫(CTLs)和平衡的Thl/Th2應(yīng)答。本論文所描述的重組融合蛋白G：125-225-F／M2：81-95(G1F／M2)，包括G蛋白的中和抗體表位片段(G：125-225)和RSV-M2蛋白的CD8+T細(xì)胞表位片段(M2：81．95)；其設(shè)計(jì)目標(biāo)是發(fā)

4、展一個(gè)安全有效的RSV疫苗。 首先構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并表達(dá)純化融合蛋白G1F／M2：將G1和F／M2：8l·95基因片段插入質(zhì)粒pET-DsbA中構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒，CEE．coliBL21(DE3)中得到表達(dá)，采用Ni+螯合親和層析法純化尿素變性的包涵體溶液，梯度透析復(fù)性，Westem-blot鑒定重組蛋白的RSV特異性，用凝血酶切割DsbA-G1F／M2而得到融合蛋白G1F／M2。 免疫原性研究：將融合蛋白G1F／M2以鋁

5、鹽為佐劑腹腔注射免疫BALB／c小鼠，或?qū)1F／M2與佐劑型載體熱休克蛋白HSP70L1形成的復(fù)合物HSP70L1一G1F／M2(HSP-G1F／M2)皮下注射免疫BALB／c小鼠，均誘導(dǎo)了高滴度的蛋白及RSV特異性的IgG抗體、中和抗體和CTL應(yīng)答，令人感興趣的是，該蛋白誘導(dǎo)了平衡的IgG1/IgG2a，這意味著誘導(dǎo)了一個(gè)Thl／Th2混合型免疫。 保護(hù)性和安全性研究：用106pfuRSV攻擊免疫后的小鼠，病毒滴定法和RT-