丙型肝炎病毒重組蛋白聯(lián)合疫苗的免疫保護(hù)性及佐劑研究.pdf

1、目的：丙型肝炎病毒（HCV）感染后易轉(zhuǎn)為慢性肝炎，且與肝硬化、肝癌關(guān)系密切，目前尚無有效的特異性防治手段。有研究表明，以T細(xì)胞表位為基礎(chǔ)的HCV疫苗免疫黑猩猩后可以預(yù)防多個型別的HCV感染，我們從HCV-C、NS3、NS4和NS5中篩選了幾個優(yōu)勢T細(xì)胞表位，制備了一種HCV-T重組蛋白抗原（簡稱T蛋白），免疫小鼠誘導(dǎo)了CTL應(yīng)答。除了細(xì)胞免疫之外，體液免疫對HCV感染也有一定的預(yù)防作用。本課題組從我國流行的HCV型別中篩選了幾個有代表性

2、的、具有高交叉保護(hù)性的E2-HVR1序列進(jìn)行組合，研制了一種重組嵌和抗原F4HVR1（簡稱F蛋白），該抗原對我國的HCV流行株具有高度的交叉保護(hù)性。HCV-E1（簡稱E蛋白）是本課題組制備的另一種基于6個有代表性亞型的E1 B細(xì)胞表位的重組抗原，初步研究結(jié)果表明，該蛋白能夠誘導(dǎo)強烈的體液免疫應(yīng)答。
　　 本研究將T、F以及E蛋白聯(lián)合和分別免疫BALB/c小鼠，研究其免疫原性、預(yù)防和治療作用；將Al（OH）3佐劑和弗氏佐劑分別與上

3、述三種蛋白混合接種于BALB/c小鼠，研究其增強疫苗免疫效果的作用。
　　 方法：
　　 1.丙型肝炎病毒重組蛋白聯(lián)合疫苗的免疫保護(hù)性研究
　　 1.1動物免疫：將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為7組，每組11只，分別為①PBS組、②T+F+E組、③T+F組、④T+E組、⑤T組、⑥F組、⑦E組，皮下多點注射免疫，佐劑用氫氧化鋁（v/v：20％），每3周免疫一次，共免疫3次。
　　 1.2體液免疫檢測：每

4、次免疫后20天和末次免疫后14天取血，分離血清，用間接ELISA檢測抗體效價。
　　 1.3細(xì)胞免疫檢測：末次免疫后14天，每組處死5只小鼠，取脾臟分離脾細(xì)胞。ELISPOT法檢測分泌IL-4和IFN-γ的淋巴細(xì)胞水平；LDH法檢測特異性CTL殺傷活性；流式細(xì)胞儀檢測CD4+T和CD8+T細(xì)胞的百分率。
　　 1.4免疫小鼠對皮下移植瘤攻擊的抑瘤作用：將每組剩余的小鼠于末次免疫后14天皮下種植1.0×106個SP2/0-

5、NS3細(xì)胞，觀察免疫小鼠對HCV感染細(xì)胞在體內(nèi)的殺傷作用。
　　 1.5丙型肝炎病毒重組蛋白治療作用：另取6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為5組，每組5只，先在背部皮下注射1.0×106個SP2/0-NS3細(xì)胞，7天后接種PBS、T+F+E、T+F、T+E、T，每2周1次，共3次。
　　 2.Al（OH）3和弗氏佐劑增強丙肝重組蛋白聯(lián)合疫苗免疫效果的研究
　　 分別用PBS、T+F+E、T+F+E+Al（OH）3

6、、T+F+E+弗氏佐劑，皮下免疫BALB/c小鼠，每2周一次，共免疫3次。用上述方法檢測體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平以及免疫小鼠對皮下移植瘤攻擊的抑瘤作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.丙型肝炎病毒重組蛋白聯(lián)合疫苗的免疫保護(hù)性研究
　　 1.1體液免疫：與PBS組相比，第三次免疫后各組均產(chǎn)生了特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體（P<0.05），各組之間F蛋白和E蛋白特異性IgG1抗體效價無顯著差異（P>0.05）。

7、T+E組E蛋白特異性IgG2a抗體效價顯著高于T+F+E組和E組（P<0.05）。結(jié)果表明T蛋白的引入不影響F和E蛋白誘導(dǎo)體液免疫的強度和特異性，另外，T與E蛋白聯(lián)合免疫后可增強E蛋白的Th1應(yīng)答。
　　 1.2分泌IL-4和IFN-γ的淋巴細(xì)胞水平：T+F+E、T+F和T+E組均顯著高于T、F、E和PBS組（p<0.05），表明聯(lián)合免疫誘導(dǎo)了高水平的Th1和Th2應(yīng)答。
　　 1.3特異性CTL殺傷活性：T+F+E、T

8、+F和T+E所誘導(dǎo)的NS3特異性CTL水平顯著高于T組（p<0.05），T+F+E組、T+F組和T+E組之間無顯著差異（P>0.05），表明F和/或E蛋白與T蛋白聯(lián)合免疫增強了T蛋白所誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答。
　　 1.4 CD4+T和CD8+T細(xì)胞：各組CD4+T和CD8+T細(xì)胞的百分率均高于PBS組（p<0.05），說明蛋白免疫后刺激了CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖。
　　 1.5免疫小鼠對皮下移植瘤攻擊的抑瘤作用：T+

9、F+E、T+F、T+E和T組60天生存率為100％，PBS組僅為50％；且各組小鼠瘤重明顯低于PBS組（P<0.05）。結(jié)果表明T+F+E、T+F、T+E和T組小鼠對SP2/0-NS3腫瘤細(xì)胞有明顯抑制作用。
　　 1.6重組蛋白的治療作用：T+F+E、T+E和T組小鼠的腫瘤在生長過程中受到不同程度的抑制。T組和T+E組小鼠的生存期高于PBS組（P<0.05）。
　　 2.Al（OH）3和弗氏佐劑增強丙肝重組蛋白聯(lián)合疫苗

10、免疫效果的研究
　　 2.1體液免疫：T+F+E+Al（OH）3和T+F+E+弗氏佐劑均刺激產(chǎn)生了特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體（P<0.05）。T+F+E+Al（OH）3組的特異性IgG2a抗體效價顯著低于T+F+E+弗氏佐劑組（P<0.05）。表明Al（OH）3佐劑和弗氏佐劑均能較好的增強機體的體液免疫，但弗氏佐劑增強細(xì)胞免疫的能力明顯強于Al（OH）3佐劑。
　　 2.2分泌IL-4和IFN-γ的淋巴細(xì)胞水

11、平：T+F+E+Al（OH）3組和T+F+E+弗氏佐劑組激活的分泌IL-4和IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)均高于T+F+E和PBS組（p<0.05）；兩佐劑組之間無顯著性差異（P>0.05）。
　　 2.3小鼠脾細(xì)胞特異性CTL殺傷活性：當(dāng)效靶比為25：1、50：1和100：1時，T+F+E+Al（OH）3組和T+F+E+弗氏佐劑組CTL殺傷活性均明顯高于T+F+E組和PBS對照組（P<0.05）；兩佐劑組之間無顯著差異（P>0.05）

12、。
　　 2.4免疫小鼠對皮下移植瘤攻擊的抑瘤作用：T+F+E+Al（OH）3組和T+F+E+弗氏佐劑組小鼠60天存活率均為100％，而T+F+E組和PBS對照組僅為40％；兩佐劑組小鼠瘤重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），但明顯低于PBS組（p<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.T+F+E、T+F、T+E能誘導(dǎo)高水平的特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫，并能有效地預(yù)防和治療SP2/0-NS3細(xì)胞的攻擊。