甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗的基礎(chǔ)研究.pdf

1、甲型肝炎(甲肝)和戊型肝炎(戊肝)同屬經(jīng)糞、口途徑傳播的急性病毒性肝炎，分別為甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)感染所致。HAV是一種無(wú)包膜的正鏈RNA病毒，主要感染兒童，其病情嚴(yán)重程度隨年齡的增加而加重。HEV同樣是一種無(wú)包膜的、單股正鏈RNA病毒，在發(fā)展中國(guó)家廣泛流行，并時(shí)有暴發(fā)性流行發(fā)生。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在HEV感染的孕婦中死亡率可達(dá)20％。此外，研究表明，甲肝和戊肝具有相似的流行特征和臨床表現(xiàn)，在國(guó)外就曾有因水源污染同時(shí)發(fā)

2、生HAV和HEV混合大流行的報(bào)道。 自1979年P(guān)rovost等用胎猴腎細(xì)胞在體外成功培養(yǎng)。HAV以米，滅活甲肝疫苗(滅活nepA疫苗)和減毒甲肝疫苗(減毒HepA疫苗)的研制相繼取得成功。前者主要在發(fā)達(dá)國(guó)家使用，我國(guó)主要以減毒HepA疫苗為主。大量的臨床研究證實(shí)，滅活和減毒HepA疫苗均具有良好的安全性和保護(hù)效力。然而，由于缺乏有效的HEV細(xì)胞培養(yǎng)體系，制備滅活或減毒戊肝疫苗(HepE疫苗)具有極大的困難。因此國(guó)內(nèi)外的研究大都

3、集中于通過(guò)基因工程技術(shù)來(lái)研制重組亞單位疫苗。有研究報(bào)道，在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用桿狀病毒表達(dá)的HEV結(jié)構(gòu)蛋白具有良好的免疫原性和保護(hù)效力，基于該重組蛋白制備的HepE疫苗目前已經(jīng)完成臨床1期研究工作。在以往的研究中，采用抗原Mapping技術(shù)，發(fā)現(xiàn)HEV中和抗原表位位于HEV開(kāi)放性閱讀框架2(ORF2)編碼的452～617位氨基酸(aa)之間，從而為開(kāi)發(fā)新型HepE疫苗奠定了基礎(chǔ)。 為了減少疫苗接種的次數(shù)，降低預(yù)防接種的成本，提

4、高疫苗的覆蓋率和免疫效果，含有兩種或兩種以上抗原、可以預(yù)防兩種或兩種以上疾病的聯(lián)合疫苗已經(jīng)成為新一代疫苗研究的熱點(diǎn)。自2001年FDA正式批準(zhǔn)甲型肝炎-乙型肝炎聯(lián)合疫苗上市使用以來(lái)，科學(xué)家們正在進(jìn)行更多新的與肝炎疫苗相關(guān)的聯(lián)合疫苗的研究和開(kāi)發(fā)。由于甲肝和戊肝同屬經(jīng)糞-口途徑傳播的急性肝炎，而且具有相似的流行特征和臨床表現(xiàn)，因此研究利開(kāi)發(fā)甲肝-戊肝聯(lián)合疫苗(HepA-HepE聯(lián)合疫苗)具有重要意義。 本研究論文報(bào)告在國(guó)內(nèi)外首次進(jìn)行

5、HepA-HepE聯(lián)合疫苗基礎(chǔ)研究的研究結(jié)果，主要分為以下3個(gè)部分： 一、華東部分地區(qū)HEV分子和血清流行病學(xué)情況調(diào)查 采用逆轉(zhuǎn)錄套式PCR(RT-nPCR)的方法，檢測(cè)從華東部分地區(qū)收集的急性HepE患者糞便或血清標(biāo)本66份。選取HEV基因片段MJ-C(4254～4560nt，BUR-82，M73812)，代替HEV全基因序列進(jìn)行HEV基因分型，從而確定HEV基因型在華東地區(qū)的流行特征。同時(shí)，從華東部分地區(qū)收集不同年齡

6、的健康體檢者血清樣本12052份，利用本室建立的間接法ELJSA檢測(cè)血清HEV IgG抗體，分析華東部分地區(qū)HEV的血清流行病學(xué)特征。 二、新型HEV VLPs的表達(dá)、純化及其免疫原性研究 采用基因工程重組技術(shù)，將HEV ORF2編碼的、含有中和抗原表位的450～617aa和439～617aa(HEV p168和HEV p179)的基因片段，連接到載體pET28a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲取表達(dá)克隆，研究重組蛋白HEV p

7、168和HEV p179在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況。并用SDS-PAGE、Western blot和直接電鏡負(fù)染等方法分析鑒定。在此基礎(chǔ)上制備實(shí)驗(yàn)性HepE疫苗，采用不同劑量(25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L和800mg/L)免疫小鼠，用ELISA檢測(cè)HEV IgG抗體的產(chǎn)生水平，用體外中和試驗(yàn)方法，檢測(cè)。HEV中和抗體的產(chǎn)生情況。 三、HepA-HepE聯(lián)合疫苗的實(shí)驗(yàn)研究 3.

8、1 HepA-HepE聯(lián)合疫苗兩種抗原組分的交叉劑量配比研究 采用不同劑量的滅活HepA疫苗(含滅活HAV抗原125、250、500U/mL)與實(shí)驗(yàn)性HepE疫苗(含重組HEV p179-VIPs抗原50、100、20μg/mL)進(jìn)行交叉劑量配比，制備9種不同的實(shí)驗(yàn)性HepA-HepE聯(lián)合疫苗。分別以3種劑量的單價(jià)滅活。HepA疫苗與3種劑量的實(shí)驗(yàn)性HepE疫苗為對(duì)照，免疫小鼠，定時(shí)采血。采用ELISA檢測(cè)HAV和HEV IgG

9、抗體的產(chǎn)生水平，采用體外中和試驗(yàn)方法，檢測(cè)HAV和HEV中和抗體的產(chǎn)生情況。探討聯(lián)合疫卣中滅活HAV抗原和重組HEVD179-VLPs抗原兩種組分問(wèn)的相互作用。 3.2 HepA．HepE聯(lián)合疫苗兩種抗原組分的最佳劑量配比研究 分別確定滅活HepA疫苗和實(shí)驗(yàn)性HepE疫苗的最佳劑量。采用最佳劑量的滅活HepA疫苗(400U/mL，)與不同劑量的實(shí)驗(yàn)性HepE疫苗(25、50、10μg/mL)進(jìn)行配比，采用最佳劑量的實(shí)驗(yàn)性

10、HepE疫苗(25μg/mL)與不同劑量的滅活HepA疫苗(100、200、400U/mL)進(jìn)行配比，制備5種不同劑量配比的實(shí)驗(yàn)性HepA-HepE聯(lián)合疫苗。分別以最佳劑量的單價(jià)滅活HepA疫苗與實(shí)驗(yàn)性HepE疫苗為對(duì)照，免疫小鼠，定時(shí)采血。采用ELISA檢測(cè)HAV利HEV IgG抗體的產(chǎn)生水平，采用體外中和試驗(yàn)方法，檢測(cè)HAV和HEV中和抗體的產(chǎn)生情況。研究聯(lián)合疫苗中滅活HAV抗原平和重組HEV p179-VLPs抗原兩種組分間的相互

11、作用。 研究結(jié)果表明： 1、年齡和居住環(huán)境為我國(guó)華東部分地區(qū)HEV感染的危險(xiǎn)因素； 2、華東部分地區(qū)HEV流行的基因型為第4基因型，毒株間具有高度的變異性，形成了第4基因型的新的亞型。結(jié)合以往研究結(jié)果認(rèn)為，我國(guó)的HEV基因型的流行特征經(jīng)歷了從第1基因型為主到第1和第4基因型共存，再到以第4基因型為主的變化過(guò)程； 3、與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的原核系統(tǒng)表達(dá)的重組HEV ORF2編碼蛋白相比，表達(dá)的HEV p179具有

12、如下特點(diǎn)： (1)文獻(xiàn)報(bào)道的用于制備重組HepE疫苗的HEV毒株均為第1基因型，而HEV p179是基于我國(guó)目前廣泛流行的第4基因型HEV毒株制備，因此具有更強(qiáng)的針對(duì)性和實(shí)用價(jià)值； (2)文獻(xiàn)報(bào)道的在原核系統(tǒng)中表達(dá)的重組HEV ORF2編碼蛋白均以包涵體形式存在，而HEY p179在原核系統(tǒng)中不僅能夠得到高效表達(dá)，而且90％的目的蛋白天然可溶； (3)與文獻(xiàn)報(bào)道的真核系統(tǒng)、原核系統(tǒng)表達(dá)的HEV VLPs相比，直徑

13、約20nm的HEV p179-VLPs僅由179aa(HEV ORF2編碼的439～617aa)組成，肽鏈長(zhǎng)度更短，是目前能夠形成HEV VLPs的最小重組HEV蛋白。此外，HEV p179-VLPs是由天然可溶的重組蛋白HEV p179形成，因此最大限度地保存了HEY中和抗原表位的天然構(gòu)象。實(shí)驗(yàn)表明，HEV p179-VLPs能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生高水平的HEV中和抗體。所以，具有更高的研究?jī)r(jià)值。 4、研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性Hep