戊型肝炎病毒ORF3蛋白的功能研究.pdf

1、研究背景：
　　戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引起的病毒性肝炎,20世紀(jì)80年代首次確認(rèn)此種病毒為傳染病的病原。隨著人們對(duì)HE研究的深入以及科學(xué)技術(shù)手段的提高,人們對(duì) HE的認(rèn)識(shí)更加深入:HE不僅流行于衛(wèi)生條件較差的地區(qū),而且發(fā)達(dá)地區(qū)被診斷為 HE的病人也日益增多。近年來, HE已成為威脅人類健康的全球性問題:患 HE的孕婦病死率可高達(dá)30％,慢性肝病基礎(chǔ)

2、的患者易感染 HEV從而誘發(fā)重型肝炎,有關(guān)慢性 HE的報(bào)道也逐漸增多。防控HE疾病已成為科學(xué)家日益關(guān)注熱點(diǎn)。
　　HEV為單股正鏈 RNA病毒,分為4個(gè)基因型,其中基因1型、2型及基因3型基因組的結(jié)構(gòu)相似,與基因4型基因組相比,結(jié)構(gòu)差異比較大。我國(guó)主要流行基因1型和基因4型。HEV全長(zhǎng)約7.2kb,有3個(gè)開放讀碼框(Open Reading Frame,ORF),其中ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,ORF2編碼戊型肝炎病毒的衣殼蛋白,OR

3、F3則編碼一個(gè)小分子蛋白,且基因1型與基因4型病毒編碼的ORF3蛋白的結(jié)構(gòu)存在差異:基因4型 ORF3蛋白 N端較1型 ORF3蛋白缺少9個(gè)氨基酸。由于缺乏合適的動(dòng)物模型和細(xì)胞模型,戊型肝炎的發(fā)病致病機(jī)理并未闡明,且 HEV編碼的小分子蛋白 ORF3蛋白的生物學(xué)功能也不明確,不同基因型的ORF3蛋白功能是否存在差異,尚無相關(guān)報(bào)道。也有文獻(xiàn)報(bào)道不同基因型致病力也是存在差異的,這種差異的原因值得探討。本研究擬以 Huh7為細(xì)胞模型,探討不同

4、型 ORF3蛋白的功能及其存在的差異,并進(jìn)一步研究相關(guān)的機(jī)制,初步探討不同基因型的HEV病毒對(duì)免疫刺激影響的差異,為戊型肝炎的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　探討基因1型及基因4型 ORF3蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞系的影響及存在的差異和可能的機(jī)制,且初步探討基因1型及基因4型 HEV病毒對(duì)免疫刺激的影響差異,為進(jìn)一步深入了解戊型肝炎的發(fā)病致病機(jī)理提供新的科學(xué)依據(jù).
　　方法:
　　1.分別構(gòu)建1型及4型 HEV完

5、整 ORF3蛋白(ORF3蛋白)的真核表達(dá)質(zhì)粒,同時(shí)利用實(shí)驗(yàn)室已有的綠色熒光蛋白標(biāo)記的ORF3真核表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞:CCK8檢測(cè)不同型 ORF3蛋白對(duì) Huh7細(xì)胞增殖的影響;PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè) ORF3對(duì)細(xì)胞周期的影響;Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同型 ORF3蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。2.用基因1型及基因4型 ORF3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 Huh7細(xì)胞,Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因 cyclinD

6、1及cyclin E的表達(dá),western blot檢測(cè) cyclinD1、cyclinE、cyclin A、cyclin B等蛋白的表達(dá);Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān) Bax、Bcl-xl基因的表達(dá), Western blot檢測(cè)相關(guān) Bax、Bcl-xl、Caspase-9等蛋白的表達(dá);免疫熒光觀察不同型ORF3蛋白對(duì) p65核轉(zhuǎn)移的影響,并用western blot證實(shí)。
　　3.采集健康人的血(檢測(cè)肝功能正常

7、,戊肝抗體、乙肝抗體及丙肝抗體陰性),Ficoll法分離外周單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用不同型的戊型肝炎病毒刺激外周單個(gè)核細(xì)胞,倒置顯微鏡觀察 PBMC的生長(zhǎng)情況,ELISA檢測(cè) INF-γ及IL-4細(xì)胞因子分泌情況。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建了基因1型及基因4型 ORF3的真核表達(dá)載體;基因1型 ORF3可以抑制肝癌細(xì)胞系 Huh7增殖活性(p<0.05

8、),基因4型無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;基因1型 ORF3蛋白可阻滯細(xì)胞周期于 G0/G1期,而基因4型 ORF3蛋白則對(duì)細(xì)胞周期無明顯抑制作用;基因1型和基因4型 ORF3蛋白均可抑制星形孢菌素所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　2.Real-time PCR示 ORF3蛋白的表達(dá)可以抑制cyclinD1及cyclin E的表達(dá),基因1型及基因4型 ORF3蛋白均可。western blot示表達(dá)基因1型 ORF3的細(xì)胞其蛋白cyclinD1、cycli

9、nE及相關(guān)的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶 CDK4、CDK6、CDK2蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比均有下降,但是基因4型則無明顯差異。表達(dá)基因1型及基因4型ORF3蛋白的細(xì)胞其 S期,和G2期相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白 cyclinA及cyclin B的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較表達(dá)量無差異;
　　3.Real-time PCR示基因1型及基因4型 ORF3蛋白均可抑制Bax及Bcl-2基因的表達(dá)。凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)示:對(duì)照組及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組加入促凋亡劑

10、后 Bax、caspase9、細(xì)胞色素 c的表達(dá)與轉(zhuǎn)染 ORF3質(zhì)粒組相比,明顯增高。
　　4.激光共聚焦顯示,表達(dá) ORF3蛋白的細(xì)胞,加入 TNF-α刺激后,p65并未出現(xiàn)核轉(zhuǎn)移,基因1型和基因4型無差異;western blot顯示:表達(dá) ORF3蛋白的細(xì)胞在受到TNF-α刺激后胞核 p65的表達(dá)量較對(duì)照組相比下降,且基因1和4型間無顯著差異。
　　5.PBMC加入不同型 HEV刺激后,隨著時(shí)間的推移可見 PBMC從單

11、個(gè)散在的狀態(tài)逐漸出現(xiàn)聚團(tuán),且聚團(tuán)的數(shù)量逐漸增多,體積變大,與基因4型相比,加入基因1型HEV的PBMC聚團(tuán)出現(xiàn)的時(shí)間更早,且聚團(tuán)的數(shù)量更多,體積更大;而沒有加入病毒的PBMC從2d-9d處于單個(gè)散在狀態(tài),未見明顯細(xì)胞聚集的現(xiàn)象。
　　6.ELISA檢測(cè) PBMC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子 INF-γ及IL-4的分泌量,INF-γ的分泌量高于基因1型組及對(duì)照組,而各組 IL-4分泌量則小于最低檢測(cè)濃度。
　　結(jié)論:
　　1.基因

12、1型 ORF3蛋白和基因4型 ORF3蛋白對(duì) Huh7細(xì)胞的影響是存在差異的,基因1型 ORF3蛋白可以抑制細(xì)胞增殖活性且阻滯細(xì)胞周期于 G0/G1期,而基因4型ORF3蛋白無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?；?型和基因4型 ORF3蛋白均可抑制新型孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　2.基因1型 ORF3可能通過抑制cyclinD1及cyclinE蛋白的表達(dá)使細(xì)胞停滯于 G0/G1期;基因1型及基因4型 ORF3蛋白通過線粒體途徑抑制星形孢菌素誘導(dǎo)的凋亡