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
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文檔簡介
1、本文主要從以下幾部分進行論述:
一.截短蛋白pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660的原核表達及其特性分析
由于蛋白質能否有效表達很難預測,實驗早期以p179為基礎共設計了20個不同長度的pORF2截短片段進行表達嘗試。利用基因重組技術構建了含有HEV ORF2的pET28a重組質粒,并在大腸桿菌中進行表達,其中13個截短蛋白可以得到高效表達。
在成功表達的1
2、3種蛋白中,我們選取了片段較長的3個重組蛋白pORF2aa439~4660、pORF2aa422~637和pORF2aa430~660進行蛋白質的可溶性分析,發(fā)現這3種不同長度的蛋白都可以在細菌裂解上清中存在,呈可溶性表達。最后根據表達蛋白所攜帶的His標簽,利用鎳離子金屬螯合親和層析技術獲得了純化蛋白。
二.截短蛋白pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660與p179、p166免
3、疫原性和抗原性的比較研究
為了進一步研究3種不同長度的截短蛋白與p166、p179的免疫原性和抗原性的差異,將純化后的5種HEV重組蛋白以生理鹽水稀釋至100mg/L,然后分別加入等體積鋁佐劑(1g/L),顛倒混勻30min,即為制備的實驗性戊肝疫苗。用皮內注射的方法分別免疫5組小鼠,每組6只,每只200μl(含抗原10μg),并于首次免疫后的第3周,第5周及第33周各進行1次加強免疫,免疫劑量和途徑與首次免疫相同。定期采集小
4、鼠血清,分別用p166、p179、pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660作為包被抗原來檢測p166、p179、pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660免疫后血清中的抗-HEV IgG抗體,觀察抗體滴度的升高、維持、下降等變化過程直至首次免疫后第35周,將同組小鼠的每一份血清在同一稀釋度下所測OD值取平均值進行統計。結果如下:
A.
5、首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,p166免疫小鼠所得血清用p166包被檢測,抗-HEV IgG抗體滴度分別為1∶1600、1∶6400、1∶51200、1∶25600、1∶3200和1∶51200;用p179、pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660包板檢測,抗體滴度相同,分別為1∶800、1∶3200、1∶25600、1∶12800、1∶3200、1∶25
6、600;
B.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,p179免疫小鼠所得血清用p166檢測,抗-HEV IgG抗體滴度分別為1∶3200、1∶12800、1∶51200、1∶25600、1∶6400、1∶51200;用 p179、pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660包板檢測,所得抗體滴度相同,均分別為1∶1600、1∶12800、1∶51200、1∶
7、12800、1∶6400、1∶51200;
C.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,pORF2aa439~660免疫小鼠所得血清用p166檢測,抗-HEV IgG抗體滴度分別為1∶12800、1∶409600、1∶1638400、1∶204800、1∶204800、1∶1638400;用p179包被檢測,抗體滴度分別為1∶3200、1∶102400、1∶819200、1∶102400、1∶20480
8、0、1∶1638400;用pORF2aa439~660檢測,抗體滴度分別為1∶6400、1∶102400、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶819200;用pORF2aa422~637檢測,抗體滴度分別為1∶3200、1∶102400、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶1638400;用pORF2aa430~660檢測,抗體滴度分別為1∶3200、1∶102400、1∶409600、1∶2
9、04800、1∶204800、1∶819200;
D.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,pORF2aa422~637免疫小鼠所得血清用p166檢測,抗-HEV IgG抗體滴度分別為1∶6400、1∶204800、1∶819200、1∶204800、1∶204800、1∶1638400;用p179檢測,抗體滴度分別為1∶3200、1∶102400、1∶819200、1∶204800、1∶204800
10、、1∶1638400;用pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660檢測,抗體滴度相同均分別為1∶6400、1∶204800、1∶819200、1∶204800、1∶204800、1∶819200;
E.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,pORF2aa430~660免疫小鼠所得血清用p166檢測,抗-HEV IgG抗體滴度分別為1∶6400、1∶4096
11、00、1∶819200、1∶204800、1∶204800、1∶819200;用p179檢測,抗體滴度分別為1∶3200、1∶102400、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶819200;用pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660檢測,抗體滴度相同均分別為1∶6400、1∶204800、1∶409600、1∶204800、1∶204800、1∶409600。
12、 F.運用生物信息學分析軟件,對p166、p179、pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660的中和抗原表位的突出情況作了分析,結果顯示5種蛋白的中和抗原表位突出面積分別為12.93,12.01,9.681,11.24以及9.372,此數據說明五種蛋白天然二聚體狀態(tài)下p166突出程度最明顯,pORF2aa430~660突出程度最弱,可以部分解釋p166的抗原性優(yōu)于其他4種截短蛋白的原因。<
13、br> 綜合上述研究結果,我們發(fā)現在相同的免疫時間點,pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660免疫小鼠的血清滴度明顯高于p166、p179的血清滴度,說明長片段蛋白的免疫原性明顯好于短片段蛋白。此外,同一份血清,在相同滴度下,用p166包被檢測所得OD值的平均值大于其他4種蛋白所檢測的OD值的平均值,經t檢驗差異具有統計學意義,提示p166的抗原性強于其他4種蛋白。
三.p16
14、6、p179、pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660免疫血清的HEV中和作用
本實驗采用基于PCR的HEV體外中和試驗,來評價p166、p179、pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660免疫小鼠血清的中和活性。結果如下:
A.p166、p179、pORF2aa439~660、pORF2aa422~637和pORF2aa4
15、30~660的小鼠免疫血清均有中和作用,其中和效價分別為1∶8、1∶8、1∶80、1∶80和1∶4。pORF2aa439~660,pORF2aa422~637免疫血清中和效價最高,pORF2aa430~660免疫血清中和效價最低。
結論:
1.在p179的基礎上進行N端和C端的延長,能夠獲得包含更多抗原表位的、具有良好可溶性的、并可以二聚體形式出現的HEV pORF2截短蛋白;
2.新的截短蛋白pORF2a
16、a439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660和p166、p179進行比較發(fā)現,5種蛋白均具有良好的免疫原性和抗原性,pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660免疫原性優(yōu)于p166和p179,而p166的抗原性優(yōu)于pORF2aa439~660、pORF2aa422~637、pORF2aa430~660和p179;
3.pORF2aa439~660、pO
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