豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的克隆與表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、I摘要豬圓環(huán)病毒2型（Pcinecircovirustype2，PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，而且還與豬皮炎與腎炎綜合癥（PDNS）、豬先天性腦震顫（CTAII）、增生性壞死性肺炎（PNP）等疾病的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)。該病毒感染豬體后能夠?qū)е聶C(jī)體免疫功能抑制，并且容易誘發(fā)雙重或多重感染，使病情復(fù)雜化，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。PCV2含有兩個(gè)主要的開放閱讀框(Openreadingframe，F(xiàn))，其中

2、F2基因編碼的核衣殼（Cap）蛋白，是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)反應(yīng)，并且PCV1與PCV2的Cap蛋白氨基酸的同源性比較低，兩者之間不存在血清交叉性反應(yīng)。因此Cap蛋白在血清學(xué)診斷及基因工程亞單位疫苗研究中具有重要意義。本研究分別利用原核表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（BEVS）對PCV2Cap蛋白進(jìn)行表達(dá)，并對其進(jìn)行免疫原性分析。首先，進(jìn)行了PCV2Cap蛋白在大腸桿菌——原核系統(tǒng)表達(dá)的研究。根據(jù)GenBan

3、k中公布的PCV2WH株（FJ598044）F2基因序列設(shè)計(jì)一對引物，以PCV2WH株基因組DNA為模板擴(kuò)增出去核定位信號(Nuclearlocalizationsignal，NLS)的F2基因，將其插入到原核表達(dá)載體pET32a()中，獲得重組表達(dá)載體pET32aCap579，然后將其轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE和WesternBlotting檢測分析，結(jié)果表明PCV2Cap5

4、79蛋白獲得了表達(dá)，蛋白分子量大小約為40kDa，主要以可溶性的形式存在，且具有良好的反應(yīng)原性。純化后測得重組Cap579蛋白的濃度大約為200gmL，將其免疫新西蘭大白兔，3次免疫獲得抗Cap579蛋白的高效免疫血清。其次，進(jìn)行了PCV2Cap蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞——真核系統(tǒng)表達(dá)的研究。為了提高PCV2Cap蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)量，人工優(yōu)化合成適用于桿狀病毒表達(dá)的PCV2F2基因，并將目的基因插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac

5、TMHTA中，獲得重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMHTAcap2，將其轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)中，經(jīng)抗性及藍(lán)白斑篩選，得到含F(xiàn)2基因的重組穿梭載體rBacCap2，轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒至對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞中，即可獲得rBaccap2重組桿狀病毒，并對病毒進(jìn)行擴(kuò)增。分別用連續(xù)稀釋法和間接免疫熒光法(Indirectimmunofluescenceassay，IFA)對重組桿狀病毒的滴度進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，這兩種方法測得的P3代病毒