豬2型圓環(huán)病毒河南株ORF2基因的克隆、序列分析及其真核表達.pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒（Porcinecircovirustype2，PCV-2）是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、圓環(huán)病毒相關疾?。≒orcinecircovirus-associateddisease，PCVAD）等相關疾病的重要病原。PCV-2的ORF2基因不僅是其主要結構蛋白的編碼基因，而且也是區(qū)分PCV-1和PCV-2的重要區(qū)域，其編碼蛋白具有良好的抗原性。本研究利用PCR技術擴增出PCV-2PDSH株和LY株ORF2基因，并進行了分子

2、克隆，成功地實現(xiàn)了PDSH株ORF2基因在BHK-21細胞中的表達，并對表達的重組蛋白進行了初步鑒定。 參照GenBank發(fā)表的PCV-2基因序列，設計合成一對引物，對PCV-2PDSH株、LY株ORF2基因進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，呈現(xiàn)一條約719bp的特異條帶，將其回收后克隆到pMD18-Teasy載體進行測序，將所測序列與已公布的PCV-2ORF2序列進行同源性比較，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹。通過擴增可以獲得7

3、02bp的PCV-2ORF2全基因，編碼233個氨基酸，分子量為27995.93D。 PCV-2河南分離株ORF2之間的核苷酸同源性為97.0-99.0％，氨基酸同源性為95.3-99.1％，其中LY株與GenBank中的xx株之間的核苷酸和氨基酸同源性最高，核苷酸同源性達98.9％，氨基酸同源性達99.1％：和國內毒株相比，PDSH株與GenBank中的HZ株、LY株與GenBank中的HANGZHOU株同源性最高達99.3％

4、；和國外毒株相比，LY株與國外的Denmark株的核苷酸同源性最高達99.6％，PDSH株與國外的Brazil株、Denmark株同源性最高達99.3％；LY株與Denmark株氨基酸同源性最高達99.6％，PDSH株與國外的Brazil株氨基酸同源性最高達，JZ株與PDSH株之間的同源性最低。 根據(jù)基因分析，設計一對帶有酶切位點的引物，利用此引物從克隆的pMD18-T-ORF2重組質粒擴增出含ORF2主要抗原位點的566bp區(qū)

5、段，經BamHⅠ和HndⅢ雙酶切，將回收的ORF2基因定向插入真核表達載體pcDNA3.0，經BamHⅠ和HindⅢ酶切、測序鑒定，得到陽性重組表達質粒pcDNA3.0-ORF2。將重組質粒pcDNA3.0-ORF2瞬時轉染到BHK-21細胞中，轉染后的細胞經RT-PCR檢測到了PCV-2ORF2基因的mRNA；經間接免疫熒光檢測表明，表達的重組蛋白能夠被PCV-2陽性血清所識別，具有良好的抗原性。 結果表明：成功構建了克隆質粒

6、pMD18-T-ORF2及其表達質粒pcDNA3.0-ORF2；pcDNA3.0/ORF2質粒在BHK-21細胞中進行了瞬時表達，在轉染的BHK-21細胞中檢測到PCV-2ORF2基因的mRNA，表達的Cap蛋白可與PCV-2抗血清發(fā)生特異性反應。 本研究成功構建了克隆質粒pMD18-T-ORF2及其真核表達質粒pcDNA3.0-ORF2；重組表達質粒在BHK-21細胞中瞬時表達了具有Cap蛋白生物學活性的蛋白。本研究為PCV-