豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)及單克隆抗體的研制及其初步應(yīng)用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒?；蛐桶≒CV1(Porcine circovirustype1，PCV1)和PCV2(Porcine circovirus type2，PCV2)。PCV1是PK15細(xì)胞系的一種污染物，對(duì)豬沒(méi)有致病性;而PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(Postweaningm

2、ultisystemic wasting syndrome，PMWS)等的主要病原。自1996年以來(lái)，PCV2感染引起的疾病在世界各地蔓延，對(duì)全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。因此，對(duì)于PCV2相關(guān)疾病的控制是人們關(guān)注的重要問(wèn)題。
　　PCV1與PCV2的基因組是相似的，都包含兩個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框，ORF1和ORF2，ORF1主要編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白，ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白，PCV1與PCV2的ORF1同源性約為85％，而O

3、RF2的同源性約66％，在PCV1與PCV2之間不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，且ORF2編碼的蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，大小約28 kD，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的抗體，因此ORF2基因是PCV2診斷及疫苗研究的熱點(diǎn)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已成為基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)具有不感染脊椎動(dòng)物、外源基因克隆量大、重組病毒篩選率高以及表達(dá)蛋白活性好的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。本研究利用重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)使PCV2-ORF2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中得到

4、表達(dá)，并以構(gòu)建的重組桿狀病毒為免疫原，利用雜交瘤技術(shù)，研制針對(duì)PCV2的單克隆抗體，為建立準(zhǔn)確快速的PCV2診斷方法奠定基礎(chǔ)。
　　首先將PCV2-ORF2基因克隆到桿狀病毒的轉(zhuǎn)移載體pFastBacTM1中，然后將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中，與DH10Bac中的穿梭載體Bacmid發(fā)生轉(zhuǎn)座，通過(guò)抗性和藍(lán)白斑篩選，得到重組桿狀病毒質(zhì)粒reBacmid-ORF2，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)reBacmid-ORF2轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞

5、，72小時(shí)后Sf9細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的DNA，進(jìn)行PCR鑒定，成功獲得了表達(dá)PCV2-ORF2基因的P1代重組桿狀病毒。檢測(cè)蛋白的表達(dá)及測(cè)定重組桿狀病毒的滴度，將所獲得的重組桿狀病毒經(jīng)Vivaflow200濃縮后，免疫6～8周齡BALB/c小鼠，免疫后的小鼠效價(jià)高者取其脾臟與Sp2/0細(xì)胞融合，將融合后的細(xì)胞用IFA進(jìn)行檢測(cè)篩選，經(jīng)多次亞克隆后得到3株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為5H6、4E2、5F7。通過(guò)IFA