豬圓環(huán)病毒2型河北地方株分離鑒定及ORF2基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、母豬繁殖障礙(Sow abortion and mortality syndrome，SAMS)、豬皮膚腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、呼吸道綜合征等

2、相關(guān)疾病的重要病原。PCV2是一種免疫抑制性病毒，損害感染豬的免疫功能，引起繼發(fā)或合并感染，造成的損失難以估計(jì)，PCV2已經(jīng)成為嚴(yán)重制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。由于病毒經(jīng)常以亞臨床感染的形式出現(xiàn)，常易被忽視，因此應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)PCV2感染的流行病學(xué)及分子生物學(xué)的研究。PCV2的ORF2基因編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，此蛋白具有良好的免疫原性，基因序列保守，可用于臨床診斷。 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)一對(duì)PCV2型特異性引物，從保定周邊3個(gè)規(guī)?；?/p>

3、豬場(chǎng)采集17份疑似PMWS的病料中提取病毒核酸，用PCR方法擴(kuò)增含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的PCV2型特異片段，酶切鑒定后證實(shí)有16份病料中有PCV2存在，表明保定周邊豬場(chǎng)中已廣泛存在PCV2感染。從3個(gè)豬場(chǎng)分別選取1份PCR檢測(cè)陽(yáng)性病料，經(jīng)處理后接種無(wú)污染的PK15細(xì)胞，盲傳6代后，用擴(kuò)增全基因組的引物P3/P4，采用PCR方法擴(kuò)增病毒的全基因組檢測(cè)細(xì)胞分離病毒的效果；回收擴(kuò)增全基因組的PCR產(chǎn)物，克隆到pMD19-T載體中，經(jīng)序列測(cè)定、

4、PCR及Sac Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定后，獲得3株分離毒的陽(yáng)性克隆株，分別命名為HBa株、HBb株、HBc株。通過(guò)多序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化樹分析，證實(shí)3個(gè)分離株之間的核苷酸同源性在98.4％～99.6％，分離株HBb、HBc之間的只相差8個(gè)堿基，具有很高的同源性。遺傳進(jìn)化樹分析證實(shí)了本試驗(yàn)分離毒與GeneBank中(2007～2008)登陸的PCV2毒株之間不存在地理位置上的相關(guān)性。3株毒的成功分離為本地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)有效的診斷防治豬圓環(huán)

5、病毒病提供了科學(xué)依據(jù)，豐富了本地區(qū)PCV2感染的流行病學(xué)資料。 根據(jù)分離株HBa基因組序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物P5/P6，以重組質(zhì)粒pMD19-T-PCV2質(zhì)粒為模板，對(duì)PCV2的ORF2基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段包含完整的ORF2閱讀框，大小為721bp。將擴(kuò)增ORF2基因片段插入到載體pMD19-T中，經(jīng)PCR、Sac Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定為HBa分離株的ORF2基因。利用DNAStar軟件對(duì)ORF2基因序列及編碼蛋白的氨基酸序

6、列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):該基因N端含有許多串聯(lián)或單聯(lián)的稀有密碼子，而稀有密碼子的使用頻率影響基因的表達(dá)；ORF2編碼蛋白的抗原表位主要位于C端，所以根據(jù)克隆的ORF2基因序列，用引物P7/P6擴(kuò)增ORF2基因后部約600bp的基因片段，克隆到融合表達(dá)載體pET-32a中。經(jīng)PCR及酶切鑒定后將陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳和Western-blotting分析，結(jié)果表明，重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸