豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學(xué)調(diào)查及ORF2基因的原核表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovurus type 2，PCV2)是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome)等相關(guān)疾病的重要病原。利用PCR技術(shù)對全國9個省規(guī)?；i場發(fā)病豬群進(jìn)行了PCV2檢測，并完成了41株：PCV2毒株的全基因組序列測定與分析。PCV2的ORF2基因不僅是其主要結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因，而且也是區(qū)分PCV1和PCV2的重要區(qū)域，其編碼蛋

2、白具有良好的抗原性。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出PCV2 FJ株ORF2基因，并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，成功實現(xiàn)了ORF2基因在大腸桿菌中的表達(dá)。 采用PCR技術(shù)，對PCV2陽性病料進(jìn)行全基因的擴(kuò)增、克隆和測序，得到1768bp或1767bp的目的基因片段。應(yīng)用DNAstar序列分析軟件對所測定的41株P(guān)CV2序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，我國PCV2流行毒株之間有很高的同源性(93.7％-100％)。從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可以看出，我國PCV2流行

3、毒株與美洲、歐洲和亞洲等國家的PCV2代表株也有很近的親緣關(guān)系。PCV2流行毒株的親緣關(guān)系與地域之間沒有十分密切的聯(lián)系。應(yīng)用計算機(jī)分析兩個主要閱讀框ORF1和ORF2并推導(dǎo)其氨基酸序列，其中ORF1的核苷酸及氨基酸之間的同源性分別為96.4％～100％和96.5％～99.7％，說明ORF1非常保守，這與其編碼蛋白的功能有關(guān)。ORF2之間的核苷酸及氨基酸同源性分別為86.3％-99.6％和88.2％～100％，變異相對于ORF1較大，與國

4、外已發(fā)表毒株的ORF2比較，發(fā)現(xiàn)變異主要發(fā)生在三個區(qū)域，其中兩個與病毒的抗原表位相對應(yīng)，推測這些變異可能與PCV2抗原性及致病性的改變有關(guān)。 采用PCR方法從已構(gòu)建好的PCV2全基因重組質(zhì)粒(pMD18-T-PCV2)中擴(kuò)增出大小為579bp的ORF2基因，亞克隆到表達(dá)載體pET-32a中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)了ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白。表達(dá)的重組蛋白為融合蛋白，分子量40Ku。經(jīng)Western-blot檢測，重組蛋白可被