豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白病毒樣顆粒的制備及其免疫原性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)可導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、母豬繁殖障礙、豬呼吸道綜合征、豬皮炎與腎病綜合征、先天性震顫和其他圓環(huán)病毒相關(guān)疾病，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。疫苗免疫是防控PCV2相關(guān)性疫病的主要手段。PCV2分離株存在基因差異，目前PCV2有PCV2a到PCV2e多個(gè)亞型。目前商品化的豬圓環(huán)疫苗主要是基于PCV2a/b亞型的全病毒滅活疫苗和基于PCV2a亞型的基因工程亞單位疫

2、苗。由于這些疫苗中存在的免疫不相關(guān)蛋白可在注射部位產(chǎn)生副反應(yīng)，病毒滅活過(guò)程中導(dǎo)致的抗原決定簇的變化而影響免疫效果。此外，由于圓環(huán)病毒在細(xì)胞中生長(zhǎng)緩慢，全病毒培養(yǎng)獲得高滴度病毒難度大，表達(dá)的抗原需要濃縮和純化而導(dǎo)致疫苗的生產(chǎn)成本增加。因此，研制新型PCV2疫苗很有必要。
　　病毒樣顆粒（VLPs）由于其表面具有重疊的抗原表位，病毒樣的結(jié)構(gòu)和能夠誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫而備受疫苗研發(fā)的青睞。為此，國(guó)內(nèi)外很多人嘗試在不同系統(tǒng)中表達(dá)重組的P

3、CV2Cap蛋白。大多數(shù)情況下，Cap蛋白以截?cái)嗷蛉L(zhǎng)的單體形式被表達(dá)。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的PCV2Cap能夠自我裝配成VLPs，所形成的VLPs在結(jié)構(gòu)和抗原性方面與天然病毒的Cap蛋白沒(méi)有區(qū)別。但由于抗原純化和濃縮的成本居高不下，導(dǎo)致目前商品化的PCV2Cap VLPs疫苗價(jià)格高昂。因此，研究廉價(jià)、高效的基于我國(guó)主要流行亞型PCV2b的亞單位疫苗替代進(jìn)口疫苗勢(shì)在必行。本研究中，我們證明基于PCV2b的Cap VLPs

4、可以在大腸桿菌中有效表達(dá)，而且研究結(jié)果顯示大腸桿菌來(lái)源的PCV2Cap VLPs可以作為制備PCV2疫苗的有效抗原。本論文研究?jī)?nèi)容分為以下四個(gè)部分：
　　1.PCV2Cap蛋白VLPs在E.coli中的可溶性表達(dá)、鑒定和純化
　　根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，將完整的PCV2ORF2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成，克隆入pET-32a(+)表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-cap。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21宿主菌中并進(jìn)行誘導(dǎo)

5、表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析、可溶性鑒定及Western-blot鑒定。結(jié)果表明：PCV2ORF2基因編碼的完整Cap蛋白在大腸桿菌中能夠可溶性表達(dá)，目的蛋白可與豬PCV2多抗發(fā)生反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。透射電鏡結(jié)果顯示Cap蛋白能夠形成直徑約為17nm-20nm的病毒樣顆粒，形態(tài)結(jié)構(gòu)與PCV2病毒粒子相似。用硫酸銨鹽析法對(duì)Cap蛋白進(jìn)行了高效純化。
　　2.PCV2Cap蛋白VLPs在小鼠體內(nèi)的免疫原性研究

6、r>　　以純化的Cap蛋白VLPs作為免疫抗原，以不同劑量抗原與卡波姆水佐劑乳化，制備Cap蛋白VLPs免疫原，免疫SPF級(jí)昆明鼠，同時(shí)設(shè)立商品化Cap VLPs組、全病毒滅活疫苗（LG株）組及佐劑對(duì)照組，用間接ELISA方法檢測(cè)抗體水平，并進(jìn)行小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。結(jié)果顯示，自制Cap VLPs免疫組抗體水平高于商品化Cap VLPs組和全病毒滅活疫苗（LG株）組；各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞受Cap VLPs刺激后，自制Cap VLP

7、s免疫組小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性顯著高于商品化Cap VLPs組和全病毒滅活疫苗（LG株）組。表明本研究制備的PCV2Cap蛋白VLPs疫苗在小鼠上具有良好的免疫原性，且誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫水平均高于商品化Cap VLPs疫苗組和全病毒滅活疫苗（LG株）組，為研究和臨床應(yīng)用PCV2Cap蛋白VLPs亞單位疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　3.PCV2Cap蛋白VLPs間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　以純化的Cap蛋白V

8、LPs作為包被抗原，建立了檢測(cè)豬抗PCV2抗體的間接ELISA方法。建立的ELISA方法的最佳反應(yīng)條件是：最適抗原包被量為1μg/孔，包被時(shí)間為37℃1h之后4℃過(guò)夜；血清作用濃度為1:400，作用時(shí)間為1.5h；二抗稀釋度為1:8000，作用時(shí)間為1h；顯色液TMB作用時(shí)間為15min；臨界值的判定標(biāo)準(zhǔn)為：樣品S/P值≥0.2235判為陽(yáng)性，S/P值＜0.1905判為陰性。所建立的ELISA方法具有良好的特異性、重復(fù)性及敏感性。選擇部

9、分疑似豬PCV2血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，該方法與商品化試劑盒檢測(cè)之間有很高的符合率。本研究建立的ELISA方法在臨床上可用于豬PCV2抗體檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。
　　4.PCV2Cap蛋白VLPs疫苗在豬體內(nèi)的免疫原性研究
　　以Cap蛋白VLPs作為抗原，與卡波姆水佐劑乳化，制備Cap蛋白VLPs疫苗，免疫20日齡PCV2抗原和抗體雙陰性健康仔豬，同時(shí)設(shè)立商品化Cap VLPs組、全病毒滅活疫苗（LG株）組及佐劑對(duì)照組，用間接EL