小反芻獸疫病毒樣顆粒的制備及其免疫原性的研究.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminantsvirus，PPRV)引起的一種高度接觸性傳染的病毒性疾病，主要感染小反芻動(dòng)物，對(duì)畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)危害，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定必須上報(bào)的疫病。目前主要依靠弱毒疫苗進(jìn)行預(yù)防，但該類疫苗難以利用血清學(xué)方法區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物，不利于該病的控制和消滅，而且弱毒疫苗還存在著毒力返強(qiáng)

2、的安全隱患。因此，研發(fā)安全、有效的新型疫苗尤為重要。病毒樣顆粒由于在結(jié)構(gòu)上與天然病毒相似，并且不含核酸，從而具有很好的免疫原性和安全性，作為新型亞單位疫苗在人類和動(dòng)物疫苗領(lǐng)域得到廣泛研究。本研究利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)PPRVH或F蛋白的病毒樣顆粒，并在小鼠和山羊上進(jìn)行了免疫原性的初步研究。
　　由于桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加工和多種修飾，表達(dá)的蛋白質(zhì)具有與天然蛋白質(zhì)相似的生物學(xué)活性

3、，基于以上優(yōu)點(diǎn)，該系統(tǒng)特別適合有囊膜病毒VLP的制備。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)小反芻獸疫病毒的M、N、H和F蛋白的重組桿狀病毒和單獨(dú)表達(dá)四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒，將重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，在無病毒系統(tǒng)中重構(gòu)病毒的出芽過程，檢測(cè)培養(yǎng)基中的病毒樣顆粒來確定病毒粒子出芽的必需結(jié)構(gòu)蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明小反芻獸疫病毒M蛋白在沒有其他結(jié)構(gòu)蛋白的參與下就可以促進(jìn)病毒粒子從感染細(xì)胞內(nèi)釋放，是構(gòu)成病毒粒子出芽的主要驅(qū)動(dòng)力。當(dāng)M蛋白與N、H和F蛋白共同表達(dá)時(shí)

4、，所形成的病毒樣顆粒形態(tài)和大小與真實(shí)病毒粒子更加相似，當(dāng)多種結(jié)構(gòu)蛋白同時(shí)表達(dá)時(shí)，VLP出芽效率提高。通過對(duì)PPRV VLP制備的研究，初步探索了PPRV的組裝和出芽機(jī)制，M蛋白是形成VLP的必要條件，其他結(jié)構(gòu)蛋白的參與可提高VLP的出芽效率和形成與天然病毒更相似的結(jié)構(gòu)。
　　病毒樣顆粒由于具有和天然病毒相似的結(jié)構(gòu)，可通過和天然病毒感染相同的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，目前已制備了多種人類和動(dòng)物病毒

5、的VLP顆粒，用于疫苗免疫研究。為了評(píng)價(jià)構(gòu)建的PPRV VLP的免疫效果，本研究選擇前期構(gòu)建的三種重組桿狀病毒rBac-MH、rBac-MF和rBac-MHF用于PPRV VLP的制備和進(jìn)行動(dòng)物免疫。用間接ELISA方法檢測(cè)血清特異性抗體的消長，用競爭ELISA進(jìn)行VLP免疫和PPRV弱毒免疫的鑒別檢驗(yàn)，用病毒微量中和試驗(yàn)進(jìn)行中和抗體檢測(cè)，用ELISPOT試驗(yàn)評(píng)價(jià)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞體外刺激后細(xì)胞因子IFN-γ的變化情況，用淋巴細(xì)胞增殖實(shí)

6、驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠和山羊的細(xì)胞免疫水平。結(jié)果表明不需添加任何佐劑，經(jīng)皮下免疫小鼠和山羊后，PPRV VLP(PPRV-H、PPRV-F和PPRV-HF)可刺激機(jī)體產(chǎn)生病毒特異性的IgG應(yīng)答、中和抗體和淋巴細(xì)胞增殖。其中，PPRV-H和PPRV-HF誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平與弱毒疫苗免疫組相當(dāng)，而PPRV-F免疫組體液免疫應(yīng)答水平略低于其他免疫組，但細(xì)胞免疫應(yīng)答效果好。以上研究結(jié)果表明，制備的PPRV VLP疫苗有確實(shí)的刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)