小反芻獸疫病毒H蛋白對(duì)病毒增殖的影響.pdf

1、小反芻獸疫（Peste des petits ruminants, PPR）是由小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus, PPRV）引起的一種嚴(yán)重的烈性、接觸性傳染病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）法定報(bào)告的動(dòng)物疫病。2007年7月我國(guó)首次發(fā)生該病，2013年12月以來(lái)該病在我國(guó)大規(guī)模流行，造成嚴(yán)重危害。因此，加強(qiáng)對(duì)小反芻獸疫病毒基礎(chǔ)及應(yīng)用研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究就小反芻獸疫病毒 H基因進(jìn)行

2、了真核表達(dá)，并研究了其過(guò)表達(dá)后對(duì)病毒增殖的影響，以期為提高疫苗產(chǎn)量提供一定的基礎(chǔ)。
　　設(shè)計(jì)引物通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增小反芻獸疫病毒N基因，連接到克隆載體pMD19-T上，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。利用SYBR GreenⅠ法進(jìn)行熒光定量PCR，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明，Ct值與質(zhì)粒拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值呈很好的線性關(guān)系，特異性和重復(fù)性良好，檢測(cè)靈敏度可達(dá)2.82拷貝/μL，是普通PCR的1000倍。
　　

3、設(shè)計(jì)引物通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增小反芻獸疫病毒H基因全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，并將其連接至真核表達(dá)載體pEGFP-C3上，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)染CHS-20細(xì)胞，并通過(guò)RT-PCR、熒光觀察及Western blot分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)H基因的表達(dá)。結(jié)果表明，H基因在CHS-20細(xì)胞內(nèi)得到了表達(dá)。
　　將pEGFP C3-PPRV H重組質(zhì)粒、空載體pEGFP-C3轉(zhuǎn)染CHS-20細(xì)胞，待H基因表達(dá)后，接種 PPRV Nigeria75/1，