小反芻獸疫病毒疫苗株與4系野毒株RT-PCR鑒別方法的建立及巖羊分離株的基因序列分析.pdf

1、小反芻獸疫（Peste des Petits Ruminants, PPR）由副粘病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus, PPRV)引起，以發(fā)熱，眼、鼻有大量漿性分泌物、潰瘍和壞死性口腔炎，胃炎，腹瀉和肺炎為特征的一種嚴(yán)重的烈性、接觸性傳染病。主要感染小反芻獸，特別是山羊和綿羊高度易感。PPR嚴(yán)重威脅著動(dòng)物衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)的發(fā)展，是需要采取嚴(yán)厲的強(qiáng)制預(yù)防，控制和撲滅的動(dòng)物疫病

2、之一。2007年7月，我國(guó)西藏自治區(qū)阿里地區(qū)日土縣發(fā)生PPR疫情，這是我國(guó)首次發(fā)生PPR。疫情發(fā)生后，立即對(duì)疫區(qū)及周邊地區(qū)的綿羊、山羊接種小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗進(jìn)行預(yù)防免疫，但是弱毒株的存在可能會(huì)干擾PPR的血清學(xué)調(diào)查，導(dǎo)致無(wú)法與野毒感染進(jìn)行區(qū)分。
　　 針對(duì)上述情況，本研究采用根據(jù)H基因的多變區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物H1a/H2b聯(lián)合OIE規(guī)定的基于N基因檢測(cè)PPRV的標(biāo)準(zhǔn)通用引物NP3/NP4，建立區(qū)分PPRV野毒株

3、與疫苗株的聯(lián)合RT-PCR方法。結(jié)果表明，針對(duì)N基因的RT-PCR方法能同時(shí)檢測(cè)PPRV野毒株與疫苗株;而針對(duì)H基因的RT-PCR方法只能檢測(cè)PPRV4系野毒株，不能檢測(cè)PPRV疫苗株。根據(jù)2次RT-PCR反應(yīng)的結(jié)果，能夠很好的區(qū)分PPRV4系野毒株與疫苗株。而且可檢測(cè)到的最低模板量可達(dá)7.7×10-3 ng/μl，該值完全可以滿足作為診斷方法的要求?？傊摍z測(cè)方法可以成功的擴(kuò)增出國(guó)內(nèi)流行的毒株，專一性好，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，因此有潛力

4、用于獸醫(yī)臨床上小反芻獸疫病毒疫苗毒與野毒的鑒別診斷。
　　 根據(jù)Genbank中發(fā)表的PPRV基因序列，我們?cè)O(shè)計(jì)14對(duì)擴(kuò)增引物、91條測(cè)序引物運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲取了覆蓋巖羊分離株（簡(jiǎn)稱Tibet/07-Y）全基因組的14個(gè)重疊片段。病毒RNA的5’及3’端的序列通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)獲取。該Tibe/07-Y分離株全長(zhǎng)為15948bp與已發(fā)表的PPRV毒株序列長(zhǎng)度相同，全基因組編碼6種結(jié)

5、構(gòu)蛋白，各個(gè)蛋白的基因起始、終止序列在進(jìn)化上的保守性很高。與PPRV基因4系毒株P(guān)PRV/China/Tibet/Geg/07-30（簡(jiǎn)稱Tibet07-30）、Turkey2000，基因2系毒株Nigeria75/1與Nigeria76/1，基因1系毒株C(o)te d' Ivoire89的核苷酸同源性分別為99.7％、92.6％、89.5％。
　　 對(duì)Tibet/07-Y的H基因進(jìn)行分子生物學(xué)特征分析，發(fā)現(xiàn)H基因由1957個(gè)

6、核苷酸組成，編碼區(qū)有1830個(gè)核苷酸共編碼609個(gè)氨基酸，與其他PPRV分離株核苷酸和氨基酸序列同源性分別為88.6％-99.7％和89.3％-99.7％。與麻疹病毒屬的其他病毒的核苷酸和氨基酸同源性為46.2-54.8％和33.4-55.2％。H蛋白的疏水區(qū)高度保守，N末端錨定區(qū)由38-58個(gè)氨基酸組成。H蛋白含有13個(gè)半胱氨酸殘基、37個(gè)脯氨酸及四個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別命名為N172 KSK175、N215 VSS218、N2