豬瘟病毒野毒株與疫苗株雙重SYBR Green I實時熒光定量PCR方法的建立.pdf

1、豬瘟病毒是導(dǎo)致豬瘟的主要原因，被世界動物組織列為必需上報的傳染病之一[1]。豬瘟是一種傳染性和死亡性價高的一種疾病，對國內(nèi)外的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的威脅。豬瘟病毒是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員，細(xì)胞表面有囊膜，遺傳物質(zhì)為正鏈RNA病毒。豬瘟病毒與同屬的其他病毒一樣，豬瘟病的的基因組全長為12.5kb，含有一個大的開放閱讀框架編碼4000個氨基酸。這個大的開放閱讀架編碼著CSFV所有的結(jié)構(gòu)蛋白C、E

2、rns、E1、E2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B[2]。目前，使用的豬瘟兔化弱毒疫苗C株能夠有效提高免疫從而減少豬瘟病的流行。但是正是由于C株疫苗的廣泛使用，使得區(qū)分接種疫苗株和野毒感染株變得困難和重要。
　　先前已經(jīng)報道過利用傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄PCR方法去區(qū)分鑒定豬瘟病毒野毒株與疫苗株。但是熒光定量PCR技術(shù)是一種快速、敏感、特異、高通量的方法所以更適合進(jìn)行快速定量的進(jìn)行檢測，而關(guān)于應(yīng)用熒光定量PCR

3、技術(shù)鑒定區(qū)分豬瘟病毒的報告已經(jīng)也有不少。如被報道的，利用TaqMan探針通過單個核苷酸的差別鑒定區(qū)分韓國豬瘟野生毒株和疫苗株的方法[3]。我國學(xué)者利用TaqMan探針根據(jù)5’UTR的差異，設(shè)計特異性引物對我國豬瘟病毒野生毒株與C株進(jìn)行鑒定區(qū)分[4]，但是SYBR Green I染料法不同于TaqMan探針法。TaqMan探針熒光定量PCR需要價格昂貴的探針，是根據(jù)探針堿基差別進(jìn)行檢測的，而SYBR Green I熒光定量PCR是利用非特

4、異性的燃料結(jié)合雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的[6]。
　　本實驗建立了一種SYBR Green I實時熒光定量PCR方法，根據(jù)E2蛋白基因的差別來區(qū)分鑒定豬瘟病毒野毒株與疫苗株。本方法具有很高的敏感性，結(jié)果顯示在每個反應(yīng)中最低能檢測出10拷貝數(shù)/μL。通過9種病毒的特異性實驗，結(jié)果顯示本方法具有很好的特異性。
　　本研究是一種敏感、特異、有效的區(qū)分鑒定豬瘟病毒野毒株與疫苗株的方法，本實驗所建立的SYBR Green I實時熒光定量PCR方