番茄斑萎病毒實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立.pdf

1、番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）是布尼亞病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的代表成員，該病毒的寄主范圍廣泛，對農業(yè)生產危害嚴重。已經被列為世界危害最大的十種植物病毒之一。TSWV目前尚無有效的防治措施，研究該病毒快速高效的檢測方法，有助于早期發(fā)現(xiàn)病毒并及時采取措施進行防治，從而減輕該病毒所造成的經濟損失。本實驗利用SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR技術，建立

2、了TSWV的快速定量定性檢測方法。
　　根據TSWV外殼蛋白N基因序列，設計了實時熒光定量PCR的特異性引物，獲得了140bp大小的片段，并將小片段克隆到PEASYTM-T5載體上，經過菌落PCR篩選、酶切、測序等結果表明，PCR擴增獲得片段與N基因部分片段同源性高，表明設計的引物特異性好;且該片段已經成功連接至載體，得到了重組質粒。
　　以得到的重組質粒作為實時熒光定量PCR的標準品，對標準品進行一系列的梯度稀釋，選擇6個

3、梯度稀釋的標準品為模板進行SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR反應，得到的標準曲線回歸方程為y=-3.538x+37.233，該擴增反應的效率為91.7％，相關系數(shù)為0.978，檢測范圍為9.84×101copies/μL～9.84×106copies/μL。熔解曲線只出現(xiàn)特異性的單個峰，而沒有明顯的引物二聚體或者非特異性擴增的峰出現(xiàn)，證明該方法具有良好的特異性。組間和組內的重復性實驗的結果CV值均小于3％，表明該方法具有良好的重復性