實時熒光定量PCR檢測巴爾通體方法的研究.pdf

1、目的:越來越多的巴爾通體物種感染人類疾病，嚴重的影響人類健康，給患者、家庭和國家造成重大的醫(yī)療衛(wèi)生經(jīng)濟負擔。本課題應用HRM技術建立快速檢測巴爾通體屬通用的方法。在確保檢測出所有巴爾通體物種的情況下，應用雙重HRM方法和雙重實時熒光定量PCR探針法建立快速鑒定區(qū)分引起心內膜炎常見的兩種病原體(Bq和Bh)，為臨床疾病的早期診斷、監(jiān)測和流行病學調查等研究提供有效的手段。
　　方法:查閱文獻查找巴爾通體屬的特異引物，應用生物信息學方法

2、查找Bh和Bq特異基因，利用Primer Express3和Beacon Designer7設計引物和探針。隨后進行常規(guī)PCR擴增，將產(chǎn)物連接到pEASY(R)-T5 Zero克隆載體上制備標準品。優(yōu)化擴增反應的退火溫度、引物探針的濃度和熔解速率;評估各方法的特異性、敏感性及重復性，分析擴增效率和線性關系。
　　結果:優(yōu)化的退火溫度均為60℃，引物濃度均為300 nmoL/L，探針濃度均為200nmoL/L和熔解速率為0.2℃/s

3、。(1) HRM方法檢測巴爾通體屬方法結果顯示特異性很高，只有巴爾通體物種擴增出熒光信號，熔解溫度為81.05℃±0.31，其他陰性對照菌株均未見熒光信號;敏感性實驗結果顯示在20μL的反應體系中，Bh最低檢出限為3.82×101個拷貝，相關系數(shù)R2為0.999，擴增效率E值為98.4％。重復性實驗結果顯示組內和組間的CV值分別為0.30％-0.62％和0.29％-0.36％。(2)雙重HRM方法檢測Bh和Bq結果顯示特異性很高;敏感性

4、實驗結果顯示在20μL的反應體系中，Bh和Bq最低檢出限分別為3.64×101個拷貝和5.62×101個拷貝，此外也顯示出良好的線性關系和擴增效率，其相關系數(shù)R2分別為0.998和0.997，E值分別為102.8％和104.7％。重復性實驗結果顯示組內和組間的CV值為0.22％-0.50％和0.50％-1.20％。(3)雙重實時探針法檢測Bh和Bq結果顯示特異性良好;敏感性實驗結果顯示在20μL的反應體系中，Bh和Bq最低檢出限分別為3

5、.64×101個拷貝和3.28×101個拷貝，相關系數(shù)R2分別為0.994和0.998，擴增效率E值分別為100.0％和103.4％;重復性實驗結果顯示組內和組間的CV值分別為0.19％-0.53％和0.49％-1.66％。建立的方法敏感性均比常規(guī)PCR提高了100倍。
　　結論:本研究建立了HRM方法特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可快速地檢測出所有的巴爾通體物種，為巴爾通體所引起的CSD、戰(zhàn)壕熱、心內膜炎、BA和卡瑞恩病等一系列