三種熒光定量pcr檢測方法比較

1、三種熒光定量PCR檢測方法比較定量pcr：以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到評(píng)估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的。常見熒光定量PCR檢測方法可分為以下幾類：(1)SYBRGreenI檢測模式SYBRGreenI是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的熒光染料。其與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，SYBRGreenI的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量

2、相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBRGreenI的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。PCR擴(kuò)增程序一般為94℃～55℃～72℃三步法，40個(gè)循環(huán)。SYBRGreenI的缺點(diǎn)：由于SYBRGreenI沒有特異性，不能識(shí)別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會(huì)結(jié)合發(fā)光，對(duì)PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會(huì)有假陽性發(fā)生。SYBRGreenI的優(yōu)點(diǎn)：

3、SYBRGreenI的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對(duì)不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價(jià)格相對(duì)較低。這對(duì)科研是很有利的，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。(2)水解探針模式(taqman探針)TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性

4、將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號(hào)的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，F(xiàn)RET探針又稱雙雜交探針，F(xiàn)RET探針由兩條相鄰探針組成，在一條探針的5`端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，另一探針的3`端標(biāo)記Red640熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時(shí)，探針結(jié)合在模板上，F(xiàn)AM基團(tuán)和Red640基團(tuán)相鄰，激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒光，作為Red640基團(tuán)的激發(fā)光被吸收，使Red640發(fā)出波長為640的熒光。當(dāng)變性時(shí)，探針游離，兩基