城市污水中病原性大腸埃希氏菌三種毒力基因的定量PCR檢測方法.pdf

1、城市污水再生利用是提高水資源綜合利用率、緩解水資源短缺的有效途徑之一。然而,污水中存在的大量病原菌,給人類健康造成了很大威脅。病原性大腸埃希氏菌是最常見的一類腸道病原菌,其致病性主要由毒力因子和相關(guān)蛋白來體現(xiàn)。這些毒力因子都有相應(yīng)的編碼基因,即毒力基因?；騟aeA編碼外膜蛋白—緊密素,它是腸出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)和腸致病性大腸埃希氏菌(enteropatho

2、genic Escherichia coli,EPEC)在腸道黏膜定居并引起粘附與脫落病變所必需的毒力因子?；騬fbE是EHEC O157:H7菌株特有的毒力基因,它編碼的脂多糖是該菌株引起腹瀉、出血性結(jié)腸炎以及溶血性尿毒綜合癥的主要毒力因子。EAgg是腸聚集性大腸埃希氏菌(enteroaggregative E.coli,EAEC)特有的毒力基因,表現(xiàn)急性和長期腹瀉等癥狀。目前國內(nèi)外關(guān)于EHEC、EPEC和EAEC的散發(fā)及爆發(fā)病例時

3、有發(fā)生。
　　本研究針對病原性大腸埃希氏菌EHEC、EPEC和EAEC的毒力基因eaeA、rfbE和EAgg,選用特異性引物,建立了實時熒光定量PCR檢測方法。利用從污水中分離出的目的核酸片段構(gòu)建重組質(zhì)粒,通過測序和BLAST比對分析,確定了PCR擴增的特異性。將重組質(zhì)粒作為模板,分別測定標(biāo)準(zhǔn)曲線,在基因 eaeA模板量8.77×100～8.77×105 copy,基因rfbE模板量4.98×100～4.98×105 copy,基

4、因EAgg模板量5.34×101～5.34×106 copy的范圍內(nèi)Ct值與模板量的對數(shù)值具有良好的線性關(guān)系(R2=0.997,R2=1.000,R2=0.996)。結(jié)合膜吸附洗脫濃縮方法,對于實際水樣,基因eaeA、rfbE和EAgg的檢測限分別為1.75×102 copy/100 mL、9.96×101 copy/100 mL和1.07×103 copy/100 mL。利用建立的定量PCR檢測方法對城市污水處理廠的進(jìn)出水進(jìn)行檢測,結(jié)