大腸埃希菌ampC基因LAMP檢測方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、一、研究目的和背景
　　 近年來，細(xì)菌耐藥性已成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)，它可導(dǎo)致患者治療的失敗、醫(yī)療費(fèi)用的增加和病死率的上升，更為嚴(yán)重的是，細(xì)菌耐藥性的進(jìn)一步發(fā)展，可能使人類重新面臨感染性疾病無藥可治的威脅。世界衛(wèi)生組織(WHO)最近警告說，如果人類不能盡快采取有效行動，細(xì)菌耐藥性危機(jī)將全面來臨。目前，幾乎所有的抗生素都有相應(yīng)的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，其中，β-內(nèi)酰胺酶引起的細(xì)菌耐藥最令人擔(dān)憂。β-內(nèi)酰胺酶已經(jīng)從初始的普通酶演變成為廣

2、譜酶、超廣譜酶(ESBLs)、碳青霉烯酶等，臨床亦發(fā)現(xiàn)對所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等。
　　 AmpC酶是一類主要由腸桿菌科細(xì)菌、枸櫞酸桿菌、銅綠假單胞菌等產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶，它能水解青霉素和第一代、第二代、第三代頭孢菌素，以及單環(huán)類β-內(nèi)酰胺類抗生素，且大多引發(fā)多重耐藥。近年來，隨著頭孢菌素類及β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛使用，AmpC酶的臨床檢出率不斷攀升，已成為革蘭陰性桿菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因。

3、r>　　 AmpC酶的合成與ampC、ampR、ampD、ampE、ampG五種基因有關(guān)。其中ampC基因是AmpC酶的結(jié)構(gòu)基因，大多存在于細(xì)菌的染色體上，部分也可存在于質(zhì)粒上，能編碼由380個氨基酸組成的、分子量為39.6KDa的AmpC酶。與染色體介導(dǎo)的AmpC酶不同，質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶大多為持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶，其產(chǎn)生亦無需抗生素的誘導(dǎo)，并且耐藥基因可迅速傳播到不同的菌屬和菌種，為耐藥危機(jī)的暴發(fā)埋下隱患。
　　 目前，

4、AmpC酶的檢測方法主要有兩類:一是粗提耐藥細(xì)菌的AmpC酶做藥敏試驗(yàn)進(jìn)行檢測，主要有頭孢西丁(FOX)敏感試驗(yàn)、AmpC酶表型篩選試驗(yàn)、氟氯西林(FCC)雙紙片擴(kuò)散協(xié)同實(shí)驗(yàn)、三維試驗(yàn)等;二是對編碼AmpC酶的基因進(jìn)行檢測。直接針對AmpC酶進(jìn)行檢查的試驗(yàn)可靠性較高，但一般需要提取酶的粗提物，操作繁瑣、比較費(fèi)時，難以在大多數(shù)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。AmpC酶的基因檢測是利用分子生物學(xué)方法測定待檢細(xì)菌中AmpC酶的基因序列，其結(jié)果準(zhǔn)確，

5、但需嚴(yán)格防止因污染造成的假陽性或假陰性結(jié)果。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）是日本學(xué)者Notomi等建立的一種新的核酸檢測技術(shù)。其特點(diǎn)是針對靶基因的6或8個區(qū)域設(shè)計(jì)4或6條特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件（65℃左右）下保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP具有簡單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，與常規(guī)PCR相比，不需模板的熱變性、溫度循環(huán)等過程，也不依賴任何專門的儀器設(shè)備，可

6、以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場的快速檢測。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR，適于大規(guī)模樣品的檢測和基層單位推廣應(yīng)用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、病原微生物檢測以及動物胚胎的性別鑒定等諸多領(lǐng)域。
　　 LAMP的反應(yīng)體系主要包括DNA模板、引物（包括內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物）、甜菜堿、dNTPs、Mg2+、Bst DNA聚合酶、Bst buffer等。為了實(shí)現(xiàn)LAMP對目的基因的準(zhǔn)確檢測，須對反

7、應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，探索體系中各種成份的最佳濃度，并對靈敏度和特異性進(jìn)行評估。由于LAMP具有很高的靈敏度，故應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐刮廴?，以防產(chǎn)生假陽性結(jié)果。
　　 大腸埃希菌是目前引起醫(yī)院感染的首位致病菌，從我國醫(yī)院對細(xì)菌耐藥監(jiān)測結(jié)果來看，大腸埃希菌的耐藥檢出率在逐年升高。特別是近十多年來，隨著廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素，尤其是第三代頭孢菌素的廣泛使用，產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌日益多見。AmpC酶的產(chǎn)生使大腸埃希菌對大量抗生素產(chǎn)生耐藥性

8、，通常包括青霉素和除頭孢匹羅和頭孢吡肟以外幾乎全部的頭孢菌素類藥物。另外，產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌也可能伴有ESBLs的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生耐廣譜頭孢菌素的現(xiàn)象。同時產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的大腸埃希菌通常還會攜帶其他的耐藥基因，這將導(dǎo)致臨床治療更加困難，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的耐藥性危機(jī)。
　　 建立適合臨床應(yīng)用的產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌篩選體系和了解產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌的流行情況是制定有效防治對策的前提。本研究旨在建立檢測大腸埃希菌ampC基因的LAM

9、P方法，驗(yàn)證將其運(yùn)用于檢測產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌的有效性，并初步探索檢測ampC基因的應(yīng)用價值。
　　 二、研究方法
　　 1.大腸埃希菌ampC基因LAMP檢測方法的建立
　　 (1)根據(jù)GenBank公布的ampC基因序列(No: NC_008490.1)，采用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer4.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，得到一套特異性LAMP引物，包括兩條外引物F3、B3，兩條內(nèi)引物FIP、BIP和兩條

10、環(huán)引物L(fēng)B、LF。建立25μl的LAMP反應(yīng)體系。
　　 (2)采用瓊脂糖凝膠電泳的方法，對LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，確定反應(yīng)體系中dNTPs、betaine（甜菜堿）、Mg2+的濃度，以及最佳的反應(yīng)時間。
　　 (3)驗(yàn)證建立的LAMP方法的特異性和靈敏度，并與PCR法進(jìn)行比較，探討LAMP法的優(yōu)勢。
　　 2.LAMP法檢測大腸埃希菌ampC基因的初步應(yīng)用(1)用建立的LAMP方法檢測54株大腸埃希菌臨床分離

11、株，并提取細(xì)菌質(zhì)粒，計(jì)算質(zhì)粒介導(dǎo)ampC基因所占的比例。
　　 (2)根據(jù)CLSI的標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B紙片擴(kuò)散法，進(jìn)行頭孢西丁紙片藥敏試驗(yàn)對54株大腸埃希菌進(jìn)行AmpC酶初篩。判斷標(biāo)準(zhǔn)為頭孢西?。?0μg/片）抑菌環(huán)直徑≤18mm為AmpC酶初篩陽性。
　　 (3)采用反復(fù)凍融的方法，粗提54株大腸埃希菌的AmpC酶，進(jìn)行三維試驗(yàn)篩選AmpC酶陽性菌株。
　　 (4)兩兩比較LAMP法、頭孢西丁紙片法和三維試驗(yàn)法對

12、大腸埃希菌AmpC酶的檢測結(jié)果，評價LAMP在對耐藥基因檢測方面的臨床應(yīng)用價值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件包，進(jìn)行x2檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)處理，P＜0.05表示有顯著差異，κ＞0.7表示吻合度較強(qiáng)。
　　 三、結(jié)果
　　 1、確定檢測大腸埃希菌ampC基因的LAMP反應(yīng)體系包括:2μl DNA模板，1.6μM內(nèi)引物（FIP和BIP），0.4μM外引物（F3和B3），0.4μM環(huán)引物(LF和LB),2.5μl10×B

13、st buffer,0.6mM dNTPs,1.0M betaine,12mM MgCl2,8UBst DNA polymerase，補(bǔ)加ddH2O至25μl。該體系在65℃下反應(yīng)60min，經(jīng)肉眼可觀察到明顯的白色沉淀，產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析，可看到典型的梯形條帶。
　　 2、LAMP的特異性與PCR一致，靈敏度比PCR高出10倍左右。
　　 3、采用LAMP和PCR兩種方法，分別對54株大腸埃希菌臨床分離株進(jìn)行

14、檢查，兩種方法的結(jié)果完全一致，均檢出ampC基因陽性菌株41株，占75.93％，陰性13株，占24.07％;并檢出由質(zhì)粒攜帶ampC基因的菌株21株，占38.89％。
　　 4、頭孢西丁藥敏試驗(yàn)篩選出對頭孢西丁敏感的大腸埃希菌32株，耐藥22株。三維試驗(yàn)檢測出AmpC酶陽性大腸埃希菌19株，陰性35株。其中耐藥菌株和AmpC酶陽性菌株均為ampC基因陽性，而ampC基因陰性的菌株均對頭孢西丁敏感且AmpC酶為陰性。
　　

15、 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，LAMP與頭孢西丁紙片藥敏試驗(yàn)和三維試驗(yàn)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，吻合度較弱（κ值分別為0.358和0.294）;頭孢西丁紙片藥敏試驗(yàn)和三維試驗(yàn)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.25)，吻合度較強(qiáng)(κ=0.882)。
　　 四、結(jié)論
　　 1、LAMP法可快速、準(zhǔn)確地檢測大腸埃希菌AmpC酶結(jié)構(gòu)基因ampC，且該方法無需特殊的儀器設(shè)備，操作簡單，適于在基層推廣應(yīng)用。
　　 2、

16、LAMP法檢測ampC基因?yàn)殛幮缘?3株大腸埃希菌，頭孢西丁紙片藥敏試驗(yàn)和三維試驗(yàn)的檢測結(jié)果均顯示AmpC酶為陰性;對頭孢西丁耐藥的22株大腸埃希菌和三維試驗(yàn)陽性的19株大腸埃希菌，LAMP法檢測結(jié)果均顯示ampC基因?yàn)殛栃?ampC基因檢測為陽性而AmpC酶檢測為陰性的大腸埃希菌，與抗生素作用后可能會誘導(dǎo)其表達(dá)AmpC酶并產(chǎn)生耐藥性。以上表明LAMP對ampC基因的檢測，有助于指導(dǎo)臨床選擇合適的抗菌藥物，減少因錯用、濫用抗生素而引起的