產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移元件的研究.pdf

1、研究目的：
　　了解臨床分離的產(chǎn)超廣譜-β內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌（ESBLs-producing Escherichia coli，ESBL-EC)的散布特性及其耐藥情況，在合理應(yīng)用抗菌藥物方面供臨床參考；通過對(duì)ESBL-EC菌株β-內(nèi)酰胺類耐藥基因和可移動(dòng)遺傳元件進(jìn)行檢測(cè)，了解ESBL-EC菌株基因分型情況和可移動(dòng)遺傳標(biāo)記存在狀況；通過轉(zhuǎn)化來驗(yàn)證ESBL可否通過質(zhì)粒來轉(zhuǎn)移播散，并研究轉(zhuǎn)化子特征，探討ESBL-EC菌株主要的耐藥傳播機(jī)

2、制，以此作為臨床防控ESBL的播散的參考依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.收集2014年1月-2014年12月從臨床各個(gè)科室分離的大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）共409株，應(yīng)用VITEK-Compact2微生物分析儀(法國(guó)bioMerieux)所配套的細(xì)菌鑒定卡和藥敏卡對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定及藥敏。ESBLs菌的檢測(cè)采取雙紙片法，由美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLs）推薦使用。最終判讀根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)

3、室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI2014年版)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。
　　2.采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)對(duì)臨床分離的ESBL-EC菌株的19種β-內(nèi)酰胺酶基因，3種插入序列元件（ISEcp、ISCR1、IS26），6種轉(zhuǎn)座子遺傳標(biāo)記(merA、tnpM、tnpR、tnpU、tnpA7、tnpA21)，3種整合子遺傳標(biāo)記(intI1、intI2、intI3)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，

4、并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)驗(yàn)證。
　　3.以ESBLs基因陽(yáng)性的E.coli為質(zhì)粒供體菌，感受態(tài)大腸埃希菌 DH5α為質(zhì)粒受體菌，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，VITEK-Compact2系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn)。
　　研究結(jié)果：
　　1.臨床分布情況：409株臨床分離的 E.coli中檢出 ESBL-EC菌株98株，23.96%（98/409）。ESBL-EC菌株主要來源于50-69歲年齡段患者(36.73%)，其次是≥

5、70歲年齡段的患者(28.57%)；主要來源科室為泌尿外科（22.45%），其次是婦科（10.20%）、骨科（9.18%）和普通外科（9.18%）；標(biāo)本主要分離自尿液（47.96%），其次是陰道分泌物（11.22%）和血液（10.20%）。
　　2.藥敏情況：ESBL-EC菌株對(duì)臨床經(jīng)常應(yīng)用的抗生素的耐藥情況如下：對(duì)氨芐西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑啉和頭孢他啶的耐藥率均高于90%，對(duì)氨曲南、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、妥布

6、霉素、慶大霉素和左氧氟沙星的耐藥率均高于60%，對(duì)頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸和呋喃妥因的耐藥率為分別為51.02%、46.93%和34.69%，對(duì)頭孢西丁和哌拉西林/他唑巴坦耐藥率相對(duì)較低，分別為16.33%和11.22%，以上幾種抗生素的耐藥率與非產(chǎn)ESBLs菌株耐藥率的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ESBL-EC菌株對(duì)阿米卡星、替加環(huán)素、亞胺培南均較敏感。
　　3.ESBL-EC基因型檢出情況：98株菌中β-內(nèi)酰胺酶

7、基因 blaTEM、blaCTX-M-9、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2和blaSHV陽(yáng)性率分別為61.22%、53.06%、32.65%、4.08%和3.06%，7株未檢出基因型（7.14%）?；蚍植家訲EM+CTX-M-9基因陽(yáng)性組（共31株）最多見，占31.63%。
　　4.ESBL基因PCR產(chǎn)物測(cè)序顯示：61株blaTEM陽(yáng)性菌株均為blaTEM-1亞型。52株blaCTX-M-9群陽(yáng)性菌株中，主要的基因型為

8、blaCTX-M-14，占94.2%（49/52），其他3株基因型分別為blaCTX-M-19、blaCTX-M-21、blaCTX-M-38。32株 blaCTX-M-1群陽(yáng)性菌株中，主要的基因型為 blaCTX-M-55，占59.4%（19/32）；其次為blaCTX-M-15和 blaCTX-M-64型，分別占31.3%（10/32）和9.4%（3/32）。
　　5.可移動(dòng)遺傳元件攜帶情況：98株ESBL-EC中，47.96

9、%（47/98）的分離菌株為Ⅰ類整合子陽(yáng)性，2.04%(2/98)的分離菌株為Ⅱ類整合子陽(yáng)性，此中有1株同時(shí)含Ⅰ類和Ⅱ類整合子，未檢出Ⅲ類整合子。整合子陽(yáng)性菌株僅對(duì)四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥率高于整合子陰性的菌株(P<0.05)。插入序列元件和轉(zhuǎn)座子遺傳標(biāo)記檢出ISEcp1、IS26、ISCR1、TnpA21和TnpM基因，以ISEcp1檢出率最高，達(dá)97.96%。
　　6.轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果顯示：42株ESBL-EC菌中，有39株菌轉(zhuǎn)化

10、后能在在篩選平板上生長(zhǎng)，其中有36株成功把ESBL基因轉(zhuǎn)到轉(zhuǎn)化子中，一些野生株攜帶的ESBL基因并不能完全轉(zhuǎn)到轉(zhuǎn)化子中，blaCTX-M轉(zhuǎn)移成功者較多見，blaTEM多數(shù)未能成功轉(zhuǎn)移
　　7.所有 ESBL-EC野生株和相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松和氨芐西林完全耐藥，可見耐藥性在兩者之間進(jìn)行了傳播。
　　研究結(jié)論：
　　1.ESBL-EC菌株耐藥情況嚴(yán)重，具有多耐藥性，對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、氨曲南、氨基糖苷類(除

11、阿米卡星外)、喹諾酮類等抗菌素耐藥率均較高，對(duì)碳青霉烯類抗生素、替加環(huán)素及哌拉西林/他唑巴坦極敏感。
　　2.本院ESBLs基因型以CTX-M型(81.63%)是最常見，TEM型次之(61.22%)，大部分臨床分離菌株檢出2種或2種以上的基因型（60.20%），以TEM+CTX-M-9陽(yáng)性組（31.63%）最常見，可見多重耐藥在臨床分離菌廣泛存在。同時(shí)攜帶TEM和CTX-M-9基因是本院ESBL-EC菌株產(chǎn)生的主要原因。本院流行的

12、blaCTX-M基因亞型主要為blaCTX-M-14，其次是blaCTX-M-55和blaCTX-M-15； blaTEM基因亞型主要是blaTEM-1。
　　3.Ⅰ類整合子在ESBL-EC菌株中分布廣泛，本院ESBLs的播散可能與ISEcp1基因的存在密切相關(guān)。
　　4.位于質(zhì)粒上的ESBL基因可通過轉(zhuǎn)化的方式進(jìn)行傳播，以blaCTX-M尤為明顯；ESBL-EC菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松和氨芐西林的耐藥性與blaCTX-M的