多重耐藥大腸埃希菌耐藥的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　 為研究多重耐藥大腸埃希菌的耐藥機(jī)制，對臨床分離的20株耐藥大腸埃希菌進(jìn)行相關(guān)耐藥基因檢測:包括22種β-內(nèi)酰胺酶、15種氨基糖苷類修飾酶、7種16SrRNA甲基化酶以及11種可移動(dòng)遺傳元件的相關(guān)基因。分析各臨床分離株所帶的耐藥基因;觀察LAP-2型β-內(nèi)酰胺酶基因與11種β-內(nèi)酰胺類藥物水解活性的關(guān)系，及與其它常見β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的進(jìn)化關(guān)系;對從20株DR-ECO檢測到的基因進(jìn)行聚類分析，以了解其同源性和進(jìn)

2、行耐藥菌株的流行病學(xué)分析。
　　 研究方法:
　　 (1)分離菌株對藥物的敏感性，采用K-B紙片擴(kuò)散法測定。
　　 (2)使用PCR法檢測22種β-內(nèi)酰胺酶、15種氨基糖苷類修飾酶、7種16SrRNA甲基化酶以及11種可移動(dòng)遺傳元件基因，以獲得其基因檢測陽性模式。并將PCR陽性產(chǎn)物純化、測序。使用測序軟件Chromas分析測序結(jié)果。
　　 (3)在SWISS-MODEL利用PDB數(shù)據(jù)庫作同源建模，獲得LA

3、P-2型β-內(nèi)酰胺酶的受體分子3D結(jié)構(gòu)，使用ArgusLab4.1軟件中的DOCK模塊作11種β-內(nèi)酰胺類藥物和棒酸β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與LAP-2型β-內(nèi)酰胺酶分子對接，比對各種β-內(nèi)酰胺酶基因序列，并用DNAMAN軟件的最大似然法進(jìn)行LAP-2型β-內(nèi)酰胺酶基因的進(jìn)化分析。
　　 (4)將測得的β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類耐藥相關(guān)基因以及可移動(dòng)遺傳元件遺傳標(biāo)記作為檢測指標(biāo)，對樣本進(jìn)行聚類分析。
　　 研究結(jié)果:
　　

4、 (1)所有菌株均對亞胺培南敏感，除兩個(gè)菌株對慶大霉素與阿米卡星敏感、兩株對氨芐西林/舒巴坦中介外，其余菌株對所有藥物（除亞胺培南）均耐藥。
　　 (2)在20株DR-ECO中，有18株檢出β-內(nèi)酰胺酶基因（共5種），其中TEM、CTX-M-1群、LAP、LAT/CMY和OXA-1群的陽性檢出率分別為50.0％、65.0％、5.0％、5.0％和25.0％;18株檢出氨基糖苷類修飾酶基因（共5種），其中aae(3)-Ⅱ、aae(

5、6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ、aadA5和aph(3')-Ⅰ的陽性檢出率分別為25％、25％、5％、65％和55％;1株檢出rmtB型16SrRNA甲基化酶基因，陽性率為5％;20株均檢出可移動(dòng)遺傳元件遺傳標(biāo)記（共7種），且陽性率均在70％以上(除IS903);其余基因型均未測出。其中一株TEM檢測涵蓋上游轉(zhuǎn)座子解離酶tnpR序列，一株CTX-M-1群經(jīng)測序比對為CTX-M-3型，一株LAP經(jīng)測序比對為LAP-2型。
　　

6、(3)11種β-內(nèi)酰胺類藥物和1種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，與LAP-2型β-內(nèi)酰胺酶對接的結(jié)合自由能由低至高前三位為:阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟。結(jié)合自由能越低，酶催化效率越高，即LAP-2型β-內(nèi)酰胺酶催化效率最高的為阿莫西林。同時(shí)LAP-2型與其它常見β-內(nèi)酰胺酶分子進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，其與TEM、SHV屬同一簇群。
　　 (4)20株細(xì)菌無完全相同的克隆，相互間具有不同的同源性和基因距離。
　　 研究結(jié)論:
　　

7、(1)通過對20株耐藥大腸埃希菌的β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類修飾酶、16SrRNA甲基化酶以及可移動(dòng)遺傳元件的相關(guān)55種基因的檢測，獲得了相關(guān)耐藥基因的陽性檢測模式。從20株細(xì)菌共檢出17種耐藥基因，其中對β-內(nèi)酰胺類耐藥的相關(guān)基因以TEM和CTX-M-1群基因?yàn)橹?對氨基糖苷類藥物的耐藥主要與aadA5和aph(3')-Ⅰ相關(guān)，與所測的16SrRNA甲基化酶基因相關(guān)性沒有明顯關(guān)系;獲得較高的可移動(dòng)遺傳元件相關(guān)基因的陽性率，其與本文所分離