大腸埃希菌aac（3）-Ⅱ耐藥基因的研究.pdf

1、自從上個世紀的青霉素工業(yè)化生產(chǎn)以來,到目前已開發(fā)了上千種抗菌素,并廣泛應(yīng)用于感染性疾病防治,取得顯著的效果,在醫(yī)學界曾以為有了抗菌素就徹底解決了感染性疾病防治問題.但隨著抗菌素的大量使用和濫用,抗菌藥物治療所引起的非感染部位微生態(tài)菌群失常而導致的疾病,如偽膜性腸炎、陰道炎等疾病給人類造成了很大的危害.如果能及時分解或滅活進入這些非感染部位的抗菌素,則可以避免或減少這種疾病.抗菌素伴侶的概念,就是可以清除在接受抗菌素治療時進入非感染部位的

2、抗菌素,從而保護非感染部位正常菌群和微生態(tài)平衡的制劑. 本研究課題從反向思維考慮,目的在于將嚴重影響抗菌藥物防治效果的抗菌素耐藥酶開發(fā)成為抗菌素伴侶.目前認為,細菌對抗菌素耐藥的機制大多是細菌產(chǎn)生了能分解或滅活抗菌素的酶,如β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類修飾酶等.利用耐藥酶滅活相應(yīng)抗菌素的特性,使到達非感染部位的抗菌藥物濃度得到減少或清除,從而使這些微生態(tài)區(qū)域(如腸道、陰道等)的正常微生物群避免遭抗菌藥物的作用,從而達到保護人體微生態(tài)環(huán)境正常

3、菌群的目的. 本實驗作為研究課題的一部分,主要研究了細菌對氨基糖苷抗生素耐藥機制中最常見和最重要的氨基糖苷類修飾酶--氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶(3)-Ⅱ(從C(3)-Ⅱ).在第一部分作為臨床基礎(chǔ)性研究,主要分析了從臨床分離的大腸埃希菌的耐藥譜,為臨床治療提供相應(yīng)的實驗室資料和為本科題提供臨床資料;在第二部分以aac(3)-Ⅱ基因為研究對象,將該基因克隆到載體pET26b中表達;同時將aac(3)-Ⅱ基因和tem-116基因用一柔性肽連

4、接后表達,以研究融合酶的活性;采用分子進化技術(shù)定向進化aac(3)-Ⅱ基因以提高其活性,為進一步提高酶活的研究以及新型抗生素的研發(fā)作相應(yīng)的基礎(chǔ)工作. 通過上述實驗,我們得到如下結(jié)果:①54株大腸埃希菌對阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、鏈霉素、大觀霉素和奈替米星的耐藥率分別為14.8﹪、77.8﹪、59.3﹪、66.7﹪、68.5﹪、61.1﹪、22.2﹪;共檢測出產(chǎn)ESBLs菌株34株,占63.0﹪.耐氨基糖苷類抗生素的

5、大腸埃希菌與其產(chǎn)ESBLs有相關(guān)性,從而表現(xiàn)出多重耐藥性.②aac(3)-Ⅱ基因在54株大腸埃希菌中檢出率為88.5﹪;重組菌BL2l(DE3)/pET26::aac(3)-Ⅱ?qū)c大霉素有耐藥性,而對其余爭5種氨基糖苷類抗生素沒有表現(xiàn)出耐藥性.③融合基因重組菌BL21(DE3)/pET28::aac(3)-Ⅱ/tem-116與aac(3)-Ⅱ基因重組菌均只對慶大霉素和卡那霉素耐藥;對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性中,融合基因重組菌與tem-

6、116基因重組菌的耐藥譜沒有差別,因此融合基因aac(3)-Ⅱ/tem-116表達的融合蛋白酶具有雙酶活性,并且與天然的單一基因酶相比,在活性上沒有差別.④通過易錯聚合酶鏈反應(yīng)的方法,對aac(3)-Ⅱ基因進行體外進化,經(jīng)過兩次的易錯PCR,獲得一突變株,其活性與原始野生株相此提高了4～5倍. 以上研究表明:(1)第一部分中,分析了大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素的耐藥性和菌株產(chǎn)ESBLs的相關(guān)情況,對于臨床上使用抗生素有一定的