大腸埃希菌質(zhì)粒編碼基因的克隆與功能研究.pdf

1、目的：
　　 篩選大腸埃希菌耐藥質(zhì)粒編碼的未知功能的新基因，并對其進行生物信息學分析、克隆、原核細胞表達和初步的功能研究，為今后大規(guī)模功能未知基因的分子遺傳學研究建立研究平臺。
　　 方法：
　　 本實驗對來自不同年份的320株多重耐藥大腸埃希菌質(zhì)粒DNA進行高通量測序，通過一系列的生物信息學工具篩選出耐藥質(zhì)粒編碼的功能未知基因，運用聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)擴增出新基因的開放閱讀框(ORF)，克隆入pUC19-

2、T載體，轉(zhuǎn)化于E.coliJM109感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性克隆，進行酶切和測序鑒定。將測序驗證成功的陽性質(zhì)粒雙酶切后與表達載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細胞E.coliBL21中，用加有抗菌藥物的瓊脂平板進行重組菌篩選。經(jīng)IPTG誘導蛋白表達，并采用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達情況。用瓊脂平皿稀釋法對對照菌與重組菌同時進行MIC測定。采用超聲破碎法進行重組菌粗酶液的大量提取，His親和層析純化粗酶，等電聚焦電泳測定其pI

3、。測序結(jié)果進一步進行氨基酸序列比對和保守結(jié)構(gòu)域、信號肽、跨膜區(qū)、疏水性等生物信息學分析。
　　 結(jié)果：
　　 1高通量測序結(jié)果：第一批數(shù)據(jù)中包含160株多重耐藥大腸埃希菌(E1)的Solexareads總數(shù)為11，077，768:可以定位到功能未知基因的序列(mappedreads)為9933，占總reads的比例約為0.09％，編碼新的未知功能的基因有532個。第二批數(shù)據(jù)包括160株多重耐藥大腸埃希菌(E2)的Sole

4、xareads總數(shù)為9，377，792;mappedreads為11906，占總reads的比例約為0.13％，編碼新的未知功能的基因有516個。
　　 2對其中的部分功能未知基因進行克隆，結(jié)果初步構(gòu)建成功50個新基因的表達載體。
　　 3細菌裂解液的SDS-PAGE電泳結(jié)果表明pET28a∷bqy09201等27株攜帶表達載體重組菌經(jīng)誘導后可以高效表達目的蛋白，pET28a∷bqy03052等21株重組菌表達的蛋白與對

5、照菌沒有顯著差異，pET28a∷bqy022和pET28a∷bqy09066重組菌表達的蛋白甚至比對照菌表達的條帶更少。
　　 4MIC結(jié)果表明：跟對照菌相比，絕大多數(shù)重組菌對抗菌藥物的耐藥性沒有顯著差異。有3株重組菌的耐藥性較對照菌明顯增加：pET∷bqy09232/E.coli重組菌對氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢唑啉有顯著耐藥性差異；pET∷bqy09201/E.coli重組菌對氨芐西林、頭孢呋辛、四環(huán)素、紅霉素有耐藥性差異；p

6、ET::bqy021/E.coli重組菌對頭孢替安有耐藥性差異。有4株重組菌的耐藥性較對照菌反而明顯下降(pET∷bqy09235/E.coli、pET∷bqy09009/E.coli、pET∷bqy03053/E.coli、pET∷bqy017/E.coli)。
　　 5測序分析驗證了bqy09201基因的開放讀碼框包含1182bp，GenBank收錄號為JF437869，編碼393個氨基酸，與網(wǎng)上公布的編碼區(qū)相符合，經(jīng)克隆、

7、表達、提取蛋白純化后，等電點測定為4.7，相對分子質(zhì)量為58kDa，與理論預期的分子量大小相符。
　　 6對Bqy09201蛋白氨基酸序列進行同源性分析表明該蛋白與美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種和擬態(tài)弧菌的相應基因具有較高的同源性，保守結(jié)構(gòu)域為KorB和未知功能的ParBcsuperfamily，為非跨膜蛋白，不含信號肽，具有一些化學修飾位點。其氨基酸含有1個N糖基化位點，1個依賴cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點，4個蛋白激酶C磷

8、酸化位點，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，5個N端豆蔻?；稽c，1個酰胺化位點。該蛋白定位于細胞質(zhì)中。
　　 結(jié)論：
　　 1新一代高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學工具對于混合樣本中新編碼基因的篩選是一種極為有效的方法。
　　 2成功克隆了50個功能未知基因，其中3個基因與細菌的耐藥性相關(guān)。
　　 3借助于生物信息學方法了解了bqy09201基因可能的性質(zhì)和功能，通過研究該基因的蛋白表達、提取純化、分子量測定、等