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1、目的:漢坦病毒(Hantavirus,HV)是腎綜合征出血熱(HemorrhagicFeverwithRenalSyndrome,HFRS)的病原體,可導(dǎo)致人類兩種疾病:HFRS和漢坦病毒肺綜合癥(HantavirusPulmonarySyndrom,HPS)。HV核蛋白(NucleocapsidProtein,NP)是其主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一,本文旨在對(duì)編碼NP蛋白的S基因在大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)BL2
2、1(DE3)中進(jìn)行克隆和表達(dá),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 方法:以pGEM-T-L99S和pGEM-T-Z10S為模板,分別經(jīng)PCR擴(kuò)增L99S和Z10S的ORF,前者經(jīng)EcoRⅠ及XhoⅠ雙酶切,后者經(jīng)SacⅠ及XhoⅠ雙酶切,純化后將二者與經(jīng)相同雙酶切所得的pET32a和pET28a載體大片段相連接,轉(zhuǎn)入E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中;在抗生素(pET32a為氨芐青霉素抗性,pET28a為卡那霉素抗性)篩選下,挑取陽(yáng)性重組子
3、。經(jīng)微量堿裂解法提取重組質(zhì)粒,以PCR法、酶切法和序列分析法進(jìn)行鑒定。繼而將正確定向克隆的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主Ecoli.BL21(DE3)感受態(tài)中,通過(guò)IPTG對(duì)重組菌進(jìn)行NP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),并使用HFRS患者陽(yáng)性血清進(jìn)行WesternBlot鑒定。同時(shí),摸索不同濃度的IPTG和不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌中目的蛋白產(chǎn)量的影響。 結(jié)果:PCR擴(kuò)增獲得的L99S基因和Z10S基因定向克隆入pET32a和pET28a后,挑取抗性篩選的陽(yáng)性
4、重組子,分別擇其一命名為:pET32a-L99S、pET32a-Z10S、pET28a-L99S和pET28a-Z10S。PCR法、酶切法和序列分析對(duì)上述重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果顯示,L99S基因和Z10S基因已經(jīng)正確連接入pET32a和pET28a載體,且未改變讀碼框架。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Ecoli.BL21(DE3)感受態(tài)中,挑取陽(yáng)性重組菌分別命名為E.coliBL21(DE3)/pET32a-L99S、E.coliBL21(DE3)/p
5、ET32a-Z10S、E.coliBL21(DE3)/pET28a-L99S和E.coliBL21(DE3)/pET28a-Z10S。IPTG誘導(dǎo)重組菌E.coliBL21(DE3)/pET32a-L99S和E.coliBL21(DE3)/pET32a-Z10S,結(jié)果顯示重組蛋白表達(dá)量達(dá)菌體總蛋白的40%;IPTG誘導(dǎo)重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-L99S和E.coliBL21(DE3)/pET28a-Z10S,結(jié)
6、果顯示重組蛋白表達(dá)量明顯低于前兩者,分別占菌體總蛋白的32%和27%。此外,經(jīng)pET32a構(gòu)建的重組蛋白除包涵體表達(dá)外還有部分蛋白以可溶性形式存在;而經(jīng)pET28a構(gòu)建的重組蛋白主要以包涵體形式存在,未見(jiàn)上清中存在目的蛋白。我們對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示:經(jīng)pET32a構(gòu)建的重組蛋白表達(dá)量受誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間的雙重影響,L99S和Z10S重組蛋白分別經(jīng)0.5mmoL、1.0mmoLIPTG誘導(dǎo)5h,表達(dá)量最高;經(jīng)pET28a構(gòu)建的重
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