中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的克隆及在大腸埃希菌中的表達(dá).pdf

1、目的： 將中華倉(cāng)鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary， CHO)細(xì)胞的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(CMP-sialic acid transporter， CMP-sat)基因進(jìn)行克隆，并在大腸埃希菌中表達(dá)，為今后進(jìn)一步研究該基因及其表達(dá)產(chǎn)物的作用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.在CHO細(xì)胞中提取總RNA。 2.RT-PCR擴(kuò)增CHO細(xì)胞的CMP-sat基因。 3.構(gòu)建CMP-sat基因的克隆載體

2、CMP/pMD18-T并測(cè)序鑒定。 4.構(gòu)建CMP-sat基因表達(dá)質(zhì)粒CMP/pET42a。 5.將CMP/pET42a在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行目的基因表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。 結(jié)果： 1.在CHO細(xì)胞中提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)清晰可見18S和28S RNA帶，且28S帶的亮度是18S帶亮度的2倍左右。 2.CMP-sat基因的RT-PCR產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見

3、1條1000bp左右的條帶，大小與報(bào)道的CMP-sat基因的理論報(bào)道大小相符，說明CMP-sat基因的RT-PCR是成功的，PCR擴(kuò)增到了特異的目的基因片段。 3.構(gòu)建的CMP/pMD18-T克隆載體中目的基因片段的測(cè)序結(jié)果與Genbank公布的中華倉(cāng)鼠CMP-sat基因序列完全相同。 4.重組的表達(dá)質(zhì)粒CMP/pET42a在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示有清晰的蛋白表達(dá)條帶，相對(duì)分子量約為36.4