耐百草枯A549細(xì)胞差異表達(dá)基因的篩選及轉(zhuǎn)運(yùn)體基因Synaptotagmin Ⅰ在耐藥形成中的作用.pdf

1、百草枯(paraquat，PQ)是一種全球廣泛使用的高效能除草劑。其對(duì)人體具有很強(qiáng)的毒性，經(jīng)消化道、皮膚、呼吸道及靜脈等吸收均可造成中毒，臨床上缺乏有效的治療措施，患者死亡率高達(dá)40-80％。我國(guó)PQ的生產(chǎn)和用量均居全球首位，近年國(guó)內(nèi)PQ中毒發(fā)病呈倍數(shù)增長(zhǎng)，防治形勢(shì)非常嚴(yán)峻。
　　PQ中毒可致全身多個(gè)臟器損傷，其中肺是受累最嚴(yán)重的靶器官，可出現(xiàn)“百草枯肺”，即早期表現(xiàn)為急性肺損傷，而后期則進(jìn)展為肺間質(zhì)纖維化，是PQ中毒患者死亡的主

2、要原因。PQ在肺組織的主動(dòng)攝取和蓄積被認(rèn)為是其誘導(dǎo)肺損傷的重要原因。有證據(jù)表明PQ在肺組織的濃聚蓄積主要依賴于多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，但迄今人們尚未成功分離哺乳動(dòng)物的多胺轉(zhuǎn)運(yùn)體。盡管近來(lái)一些研究證實(shí)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(OCTs)、P糖蛋白(P-gp)及多重耐藥相關(guān)蛋白(MRPs)等也與PQ的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，然而PQ在肺組織細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的確切機(jī)制尚不清楚。
　　近年，有研究通過(guò)對(duì)耐PQ的突變植株（牛筋草、擬南芥等）其耐藥機(jī)制的分析，獲

3、得了PQ在植物內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的重要信息，這為研究人體PQ跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供了新思路。但迄今，尚未發(fā)現(xiàn)存在對(duì)PQ耐藥的人體細(xì)胞可用于類似研究。
　　本研究中，我們借鑒腫瘤學(xué)常用的構(gòu)建耐藥細(xì)胞模型的方法，首先，通過(guò)濃度遞增、周期暴露PQ誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞(A549)，獲得對(duì)PQ耐藥的A549細(xì)胞(A549/PQ)，并觀察了其生物學(xué)特性;其次，以基因芯片技術(shù)篩查了A549/PQ細(xì)胞與親本細(xì)胞的差異表達(dá)基因，并結(jié)合文獻(xiàn)篩選了5個(gè)表達(dá)明顯上調(diào)的轉(zhuǎn)運(yùn)

4、體基因作為候選基因;第三，通過(guò)RT-PCR和Western blot對(duì)5個(gè)候選基因進(jìn)行表達(dá)的驗(yàn)證，并考察這些基因表達(dá)與PQ急性暴露的關(guān)系，最后確認(rèn)一個(gè)基因SynaptotagminⅠ(SYT1)可能與A549/PQ細(xì)胞耐藥有關(guān);第四，以shRNA技術(shù)抑制A549/PQ細(xì)胞SYT1的表達(dá)，觀察SYT1沉默對(duì)A549/PQ細(xì)胞生物學(xué)特性及細(xì)胞內(nèi)PQ濃度的影響，初步確認(rèn)SYT1基因在A549/PQ細(xì)胞形成耐藥中的作用與機(jī)制。
　　結(jié)果發(fā)

5、現(xiàn)，與親本細(xì)胞比，A549/PQ細(xì)胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞間隙小;細(xì)胞的倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng);細(xì)胞周期分析表明耐藥組G0/G1期細(xì)胞明顯增多，而S期細(xì)胞明顯減少;CCK-8檢測(cè)表明PQ暴露后A549/PQ存活率明顯高于親本細(xì)胞，其對(duì)PQ的耐藥指數(shù)7.98，為中度耐藥;LDH釋放實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PQ誘導(dǎo)的A549/PQ細(xì)胞損傷明顯輕于親本細(xì)胞;流式細(xì)胞檢測(cè)表明PQ誘導(dǎo)的A549/PQ細(xì)胞早期凋亡率低于親本細(xì)胞;HPLC法測(cè)得暴露后A549/PQ

6、細(xì)胞內(nèi)PQ濃度明顯低于親本細(xì)胞。表明A549/PQ細(xì)胞與親本細(xì)胞間存在明顯的生物學(xué)差異，且細(xì)胞內(nèi)濃度降低預(yù)示耐藥細(xì)胞可能存在拮抗PQ蓄積的機(jī)制。
　　基因芯片技術(shù)篩查表明，A549/PQ細(xì)胞與親本細(xì)胞間共有3335個(gè)差異表達(dá)基因，其中顯著上調(diào)的1555個(gè)，顯著下調(diào)的有1780個(gè)。功能涉及轉(zhuǎn)運(yùn)體、胞內(nèi)蛋白代謝與修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體結(jié)合、酶活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞支架蛋白與結(jié)合等。其中，兩組間存在126個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（51個(gè)上調(diào)，75個(gè)

7、下調(diào)），結(jié)合文獻(xiàn)分析，表達(dá)上調(diào)最明顯的5個(gè)基因包括DNM1，STEAP2, CDH1，SLC7A2, SYT1等可能參與A549/PQ耐藥的形成機(jī)制。
　　RT-PCR驗(yàn)證顯示A549/PQ細(xì)胞上述5個(gè)候選基因表達(dá)均明顯增強(qiáng)，與芯片結(jié)果一致。但給予800μmol/L的PQ暴露，不管是A549/PQ細(xì)胞還是親本細(xì)胞，其DNM1、STEAP2、CDH1、SLC7A2 mRNA表達(dá)均未能隨著PQ的暴露上調(diào)。而兩組細(xì)胞內(nèi)SYT1mRNA的

8、表達(dá)在PQ急性暴露后均出現(xiàn)明顯升高，提示SYT1可能參與了PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程，并在A549/PQ細(xì)胞形成耐藥中發(fā)揮重要作用。
　　利用shRNA技術(shù)沉默A549/PQ的SYT1基因，并予PQ暴露，結(jié)果干擾后的A549/PQ細(xì)胞存活率較前明顯下降， LDH釋放明顯增加，流式細(xì)胞技術(shù)及凋亡蛋白Bax/Bcl-2檢測(cè)均提示早期凋亡較前明顯增加，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)干擾后細(xì)胞在PQ暴露后皺縮明顯，胞體顏色加深，顯示損傷更明顯。此外， HPL

9、C法測(cè)得干擾后細(xì)胞內(nèi)PQ濃度較前顯著升高，且明顯高于親本細(xì)胞。進(jìn)一步觀察到PQ暴露可使A549/PQ及親本細(xì)胞囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白SYT1、SNAP25、Rab26表達(dá)明顯上調(diào)，提示PQ暴露可使兩組細(xì)胞囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)加強(qiáng);而SYT1基因沉默可明顯抑制A549/PQ細(xì)胞內(nèi)上述囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)。表明，SYT1基因沉默可完全逆轉(zhuǎn)A549/PQ細(xì)胞對(duì)PQ的耐藥性，且細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制，伴隨胞內(nèi)PQ蓄積增加。
　　根據(jù)以上研究結(jié)

10、果，我們得出如下結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了對(duì)PQ耐藥的A549細(xì)胞(A549/PQ)，其生物學(xué)特征與親本細(xì)胞存在明顯差異。暴露后A549/PQ細(xì)胞內(nèi)PQ濃度明顯低于親本細(xì)胞，提示A549/PQ細(xì)胞內(nèi)存在拮抗PQ蓄積的機(jī)制。這為PQ毒理及其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究提供了良好的細(xì)胞模型。
　　2、A459/PQ細(xì)胞與親本細(xì)胞的基因表達(dá)存在明顯差異，差異表達(dá)基因功能涉及轉(zhuǎn)運(yùn)體、胞內(nèi)蛋白代謝與修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體結(jié)合、酶活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞支架蛋

11、白與結(jié)合等，提示A549/PQ細(xì)胞對(duì)PQ耐藥是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過(guò)程。
　　3、A549/PQ細(xì)胞與親本細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)存在明顯差異。經(jīng)驗(yàn)證SYT1在親本細(xì)胞低表達(dá)，而在A549/PQ細(xì)胞呈高表達(dá)，且兩組細(xì)胞SYT1表達(dá)在PQ急性暴露后均可進(jìn)一步升高，提示SYT1可能參與PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激代償過(guò)程，并在A549/PQ細(xì)胞拮抗PQ毒性形成耐藥中發(fā)揮重要作用。
　　4、成功構(gòu)建含SYT1-RNAi的慢病毒載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)A549

12、/PQ細(xì)胞目的基因及蛋白表達(dá)的下調(diào)，且SYT1基因沉默對(duì)A549/PQ細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。
　　5、SYT1基因沉默可完全消除A549/PQ細(xì)胞對(duì)PQ的耐藥性，且其對(duì)PQ毒性的敏感性更高于親本細(xì)胞，表明SYT1在A549/PQ細(xì)胞拮抗PQ毒性形成耐藥作用中起著至關(guān)重要的作用。
　　6、SYT1基因沉默明顯抑制A549/PQ細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞內(nèi)PQ濃度因此而升高，提示SYT1調(diào)控的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)可能參與了A549/PQ細(xì)胞PQ排出