乳酸轉運體調控谷氨酸轉運體在癲癇發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、癲癇是一種神經系統(tǒng)疾病,通常是指大腦神經元突然異常放電,導致各種臨床表現反復發(fā)作的慢性疾病。難治性癲癇也稱頑固性癲癇,一般情況下,每月發(fā)病超過1次,正確用藥超過3種,正規(guī)治療時間超過2年仍無療效者,可視為難治性癲癇[1]。大約30％的癲癇患者屬于難治性癲癇[2]。我國癲癇患病率約為5‰,其中難治性癲癇患者有上百萬名,給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔和精神負擔。幾十年來,利用體外及體內癲癇發(fā)作模型努力探討自發(fā)性癲癇反復發(fā)作(癲癇病患者的大

2、腦的決定性標志)的分子和細胞機制。盡管我們在理解癲癇發(fā)生中獲得巨大的進步,但是調查人員仍然沒有制定可靠致癇病灶的生物標志物或替代標志物。目前對于導致癲癇發(fā)生的病理機制知之甚少,尤其是累積事件比如頭部外傷,炎癥,或長期熱性驚厥所觸發(fā)的癲癇[3]。癲癇治療面臨的主要挑戰(zhàn)是癲癇固有的復雜性和異質性以及癲癇發(fā)作表現出的不同的遺傳易感性。因此,癲癇發(fā)作共享一個基本病理生理機制是不可能的。過去幾十年來,抗癲癇治療的總目標是影響或者阻止原發(fā)性癲癇發(fā)作

3、的急性過[4-6]。目前癲癇治療一方面是急需要針對疾病發(fā)展變化的治療,全面或部分阻止癲癇發(fā)作的反復發(fā)作。癲癇治療的另一方面是減少或阻止癲癇發(fā)作所致的并發(fā)癥。比如認知障礙,心理障礙所造成的危害。迄今為止,在動物模型中驗證的癲癇發(fā)病過程中的分子和細胞改變包括:神經元損傷和細胞死亡,軸突和樹突的可塑性,突觸前和突觸后的修飾,神經發(fā)生,神經炎癥,膠質細胞活化,血管損傷和血管生成,細胞外基質破裂,離子通道結構和功能的改變[7]。近年來,研究發(fā)現癲

4、癇發(fā)生和能量代謝失衡關系密切,能量代謝物質不平衡可以誘發(fā)癲癇發(fā)生。比如谷氨酸是中樞神經系統(tǒng)最主要的興奮性神經遞質,廣泛分布于中樞神經系統(tǒng),多種致癇機制通過谷氨酸遞質及其受體途徑導致癲癇發(fā)生。相關文獻報道乳酸及乳酸轉運體在動物模型的癲癇發(fā)生中起到重要作用,轉運體的活動不僅直接反映突觸信息的傳遞,當轉運體的重攝取功能異常,就可以導致神經遞質在突觸間隙的濃度變化,從而引起病理生理改變,如果突觸前遞質質量異常,不僅突觸后的受體出現數量改變,而且

5、突觸前的轉運體也會發(fā)生代償性變化,這種轉運體的改變要比受體的改變更敏感、更直接。近年來一些研究發(fā)現轉運體對癲癇的發(fā)生和抗癲癇藥的作用機理、新藥開發(fā)都出現了新的看法?；诖?我們進行以下研究:
　　第一部分 MCT4在癲癇動物模型和臨床癲癇樣本表達分析
　　目的:研究MCT4在癲癇動物模型和臨床癲癇樣本表達情況。方法:從第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經外科標本庫中隨機選取30例顳葉癲癇組織標本作為實驗組,12例外傷組織標本作為對照組。

6、將大鼠分為生理鹽水對照組、SE4h、SE12h、SE1d、SE3d、SE7d、SE14d、SE28d、SE60d組,每組8只。建立大鼠氯化鋰-匹羅卡品模型,在模型建立成功后在不同時間點收集大鼠顳葉及海馬組織。利用西式印跡檢測MCT4在癲癇大鼠皮層及海馬組織表達,利用西式印跡和免疫組織化學檢測MCT4在癲癇樣本中表達情況,同時對臨床癲癇樣本進行甲基化PCR分析。結果:在西式印跡實驗中,MCT4在癲癇模型顳葉皮層中急性期開始表達降低,在潛伏

7、期表達達到最低水平,MCT4在海馬的表達和顳葉皮層基本一致。在臨床癲癇樣本中MCT4表達降低。利用甲基化PCR方法證實MCT4在癲癇樣本中表達減少與MCT4啟動子區(qū)過渡甲基化有關。結論:無論是在癲癇模型還是臨床癲癇樣本中,MCT4表達均降低,研究還發(fā)現MCT4在癲癇樣本中表達減少與MCT4啟動子區(qū)過渡甲基化有關,這提示MCT4可能與癲癇發(fā)病機制密切相關。
　　第二部分 MCT4在癲癇發(fā)病中的作用分析
　　目的:研究MCT4在

8、癲癇發(fā)病中的作用。方法:建立大鼠皮層星形膠質細胞原代培養(yǎng)模型,在模型建立成功后將含有MCT4shRNA的慢病毒顆粒感染原代培養(yǎng)星形膠質細胞,然后通過細胞免疫熒光方法檢測鑒定。利用MTT方法驗證干涉MCT4對大鼠星形膠質細胞增殖能力的影響。同時采用流式細胞儀技術,驗證干涉MCT4對大鼠星形膠質細胞凋亡及細胞周期影響。利用MCT4阻斷劑阻斷MCT4信號,觀察阻斷MCT4信號對神經元電活動影響。結果:成功構建MCT4干涉的原代培養(yǎng)的星形膠質細

9、胞模型,MTT結果顯示原代星形膠質細胞干涉MCT4后,細胞增殖能力顯著減弱。流式結果證實原代細胞中干涉MCT4后,顯著促進細胞凋亡。流式結果也證實原代細胞中干涉MCT4后導致細胞發(fā)生G1期阻滯。膜片鉗結果證明:給予癲癇大鼠海馬MCT4信號阻斷劑后,神經元興奮性增加。結論:在大鼠的原代培養(yǎng)星形膠質細胞中干涉MCT4可以導致細胞增殖能力減弱,流式細胞儀技術分析顯示干涉MCT4促進細胞凋亡并且導致細胞發(fā)生G1期阻滯。而且干涉MCT4后促使神經

10、元興奮性增高。這些結果提示MCT4在正常星形膠質細胞的增殖、凋亡以及細胞周期方面扮演重要作用,并且MCT4表達對維持正常神經元興奮性表達起到重要作用,因此MCT4在癲癇患者病灶中表達減少,可能是癲癇反復發(fā)作的一個重要原因。
　　第三部分 MCT4在癲癇發(fā)病中調控機制研究
　　目的:研究MCT4在癲癇發(fā)病中調控機制研究。方法:建立大鼠皮層星形膠質細胞原代培養(yǎng)模型,在模型建立成功后將含有MCT4shRNA的慢病毒顆粒感染原代培養(yǎng)

11、星形膠質細胞,然后收集蛋白利用西式印跡方法檢測EAAT1表達情況。利用免疫共沉淀檢測星形膠質細胞中MCT4是否和EAAT1相互結合。同時對所用癲癇樣本進行免疫組織化學染色,檢測MCT4和EAAT1在癲癇樣本中表達情況。在原代培養(yǎng)的星形膠質細胞中加入放線菌酮,觀察干涉MCT4后對EAAT1穩(wěn)定性是否有影響。結果:大鼠星膠質細胞中干涉MCT4后可以導致EAAT1表達降低,免疫共沉淀證明了在原代培養(yǎng)星形膠質細胞中MCT4和EAAT1是相互結合

12、的。免疫組織化學證實癲癇病灶中MCT4和EAAT1表達具有臨床相關性。放線菌酮實驗證實,在原代培養(yǎng)的星形膠質細胞中干涉MCT4可以導致EAAT1穩(wěn)定性減弱。結論:星形膠質細胞中干涉MCT4可以導致EAAT1表達減少,并且免疫共沉淀也證實了在星形膠質細胞中EAAT1和MCT4相互作用,這提示在星形膠質細胞中MCT4可能調控EAAT1表達。斯皮爾曼等級相關性分析證實了MCT4和EAAT1在癲癇病灶中的表達具有臨床相關性。放線菌酮實驗進一步證