胱氨酸-谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在脂多糖促進(jìn)肺內(nèi)谷氨酸釋放中的作用和機(jī)制的初步探討.pdf

1、第一章胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在脂多糖促進(jìn)肺內(nèi)谷氨酸釋放中的作用。 目的：研究胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（Xc-）在肺內(nèi)各種細(xì)胞上的表達(dá)以及其在LPS所致肺細(xì)胞Glu釋放中的作用。 方法： 1.以人支氣管上皮細(xì)胞株（HBEc）、人肺腺癌細(xì)胞株（A549）和人胚肺成纖維細(xì)胞株（HLF-02）作為人肺支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞的代表，采用RT-PCR檢測(cè)這三種肺細(xì)胞的Xc-表達(dá)。 2.應(yīng)用L-同型半胱氨

2、酸（L-HCA）抑制Xc-及無胱氨酸培養(yǎng)的方法終止Xc-作用，觀察在此情況下LPS所致肺細(xì)胞Glu釋放的變化，以探討Xc-在LPS所致肺細(xì)胞Glu釋放中的作用。采用比色法測(cè)定培養(yǎng)液中Glu濃度和乳酸脫氫酶（LDH）的活性，反映肺細(xì)胞Glu的釋放和細(xì)胞膜的完整性；比色法檢測(cè)去除細(xì)胞外胱氨酸和L-HCA對(duì)LPS所致A549細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）含量的影響，以進(jìn)一步確定對(duì)Xc-的阻斷效應(yīng)。 3.腹腔注射LPS，觀察Xc-抑制劑L-H

3、CA對(duì)小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中Glu濃度的影響，進(jìn)一步在整體水平論證Xc-在LPS致肺細(xì)胞Glu釋放中的作用。 結(jié)果： 1.0.3～100.0ng/ml LPS處理A549細(xì)胞8h可以促進(jìn)Glu的釋放。其中LPS為1.0ng/ml時(shí)A549細(xì)胞釋放Glu最顯著，且在作用8h時(shí)Glu釋放達(dá)最大。 2.LPS（1.0ng/ml）分別處理A549、HBEc和HLF-02細(xì)胞8h，發(fā)現(xiàn)LPS可促進(jìn)這三種細(xì)胞釋放

4、Glu，其中LPS促進(jìn)A549細(xì)胞釋放Glu最顯著，與對(duì)照組相比增加391.5％。 3.同時(shí)還測(cè)定上述條件培養(yǎng)液中的LDH濃度，與對(duì)照組相比無明顯改變，提示在本實(shí)驗(yàn)所用的LPS濃度和作用時(shí)間范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，因而不會(huì)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)的Glu非特異釋放。 4.RT-PCR證實(shí)Xc-的輕鏈xCT和重鏈4F2hc mRNA在A549、HBEc和HLF-02細(xì)胞均呈陽性表達(dá)，正常情況下，HLF-02細(xì)胞xCT mRNA表達(dá)最明

5、顯，HBEc細(xì)胞的4F2hc mRNA表達(dá)最強(qiáng)。A549細(xì)胞Xc-的輕鏈和重鏈mRNA在LPS處理后表達(dá)增強(qiáng)最為明顯。 5.A549、HBEc和HLF-02細(xì)胞應(yīng)用L-HCA（0.9mg/ml）預(yù)處理30min，再加入LPS作用8h，Glu釋放均明顯受到抑制。而單用L-HCA對(duì)各細(xì)胞的Glu釋放沒有影響。同時(shí)證實(shí)LPS能夠促進(jìn)A549細(xì)胞合成GSH，但在L-HCA干預(yù)后GSH的合成顯著抑制。用無胱氨酸培基替代正常培基LPS不再能

6、促進(jìn)A549細(xì)胞釋放Glu和合成GSH。 6.LPS（10.0mg/kg）處理小鼠6h能明顯增加BALF中Glu濃度，而L-HCA（4.5mg/kg）預(yù)處理30min，BALF中Glu濃度顯著降低，與LPS組比較存在顯著性差異。 結(jié)論： 1.LPS可促進(jìn)不同肺細(xì)胞釋放Glu，且呈現(xiàn)一定的劑量和時(shí)間依賴性。 2.本研究證實(shí)肺的不同種類細(xì)胞HBEc、A549和HLF-02上均存在xCT和4F2hc mRNA表

7、達(dá)，說明Xc-在肺內(nèi)不同細(xì)胞普遍表達(dá)。并且還首次發(fā)現(xiàn)Xc-介導(dǎo)LPS所致肺細(xì)胞Glu的釋放過程。 第二章脂多糖促進(jìn)A549細(xì)胞釋放谷氨酸機(jī)制的初步探討。 目的：初步探討LPS促進(jìn)A549細(xì)胞Glu釋放的機(jī)制，為急性肺損傷的治療提供新的靶點(diǎn)。 方法： 1.以A549為研究對(duì)象，初步探討LPS促進(jìn)肺釋放Glu的機(jī)制。分別觀察Ca2+螯合劑（EGTA）、基因表達(dá)抑制劑放線菌素D（actinomycin，ActD）和

8、一氧化氮合酶抑制劑（L-NAME）預(yù)處理后對(duì)LPS致其釋放Glu濃度的變化，以探討細(xì)胞外Ca2+、基因轉(zhuǎn)錄和NO在調(diào)節(jié)LPS所致肺細(xì)胞釋放Glu中的相關(guān)關(guān)系。 2.細(xì)胞內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）等與Glu合成相關(guān)酶的活性采用生化方法測(cè)定，L-谷氨酸脫氫酶（L-GDH）的含量采用ELISA測(cè)定，培養(yǎng)基中NO測(cè)定采用硝酸還原酶法測(cè)定。 3.xCT、4F2hc、GOT和L-GDH mRNA的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定

9、量PCR進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果： 1.應(yīng)用ActD（3.5μg/ml）預(yù)處理A549細(xì)胞30min后加入LPS（1.0ng/ml）繼續(xù)培養(yǎng)8h，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞Glu的釋放明顯受到抑制。而EGTA（18.7mg/ml）預(yù)處理A549細(xì)胞30min，則不能抑制LPS所致A549細(xì)胞釋放Glu。 2.1.0ng/ml的LPS不能引起A549細(xì)胞NO釋放的改變，并且未觀察到一氧化氮合酶抑制劑（L-NAME）預(yù)處理對(duì)LPS所致

10、A549細(xì)胞釋放Glu增加的影響。 3.為了解LPS對(duì)肺細(xì)胞Glu合成相關(guān)酶的影響，本實(shí)驗(yàn)觀察了A549細(xì)胞內(nèi)GOT、GPT的活性和L-GDH的含量變化。發(fā)現(xiàn)LPS增強(qiáng)GOT的活性并可提高L-GDH的含量，但對(duì)GPT的活性沒有影響。 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示LPS上調(diào)A549細(xì)胞xCT、4F2hc、GOT和L-GDH mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS促進(jìn)A549細(xì)胞Glu的釋放并上調(diào)x

11、CT、4F2hc、L-GDH和GOT mRNA的表達(dá)，而mRNA合成抑制劑ActD能明顯抑制LPS所致的A549細(xì)胞Glu的釋放。提示LPS促進(jìn)A549細(xì)胞Glu釋放的機(jī)制有賴于基因轉(zhuǎn)錄的過程。 2.LPS所致A549細(xì)胞釋放Glu增多可能與Glu合成相關(guān)酶GOT的活性增強(qiáng)及L-GDH含量增高有關(guān)。 3.本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)細(xì)胞外Ca2+不參與LPS引起的A549細(xì)胞釋放Glu。 4.本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)NO不參與低濃度LP