胱氨酸-谷氨酸轉(zhuǎn)運體在脂多糖促進肺內(nèi)谷氨酸釋放中的作用和機制的初步探討.pdf

1、第一章胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運體在脂多糖促進肺內(nèi)谷氨酸釋放中的作用。 目的：研究胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運體（Xc-）在肺內(nèi)各種細胞上的表達以及其在LPS所致肺細胞Glu釋放中的作用。 方法： 1.以人支氣管上皮細胞株（HBEc）、人肺腺癌細胞株（A549）和人胚肺成纖維細胞株（HLF-02）作為人肺支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞和肺成纖維細胞的代表，采用RT-PCR檢測這三種肺細胞的Xc-表達。 2.應用L-同型半胱氨

2、酸（L-HCA）抑制Xc-及無胱氨酸培養(yǎng)的方法終止Xc-作用，觀察在此情況下LPS所致肺細胞Glu釋放的變化，以探討Xc-在LPS所致肺細胞Glu釋放中的作用。采用比色法測定培養(yǎng)液中Glu濃度和乳酸脫氫酶（LDH）的活性，反映肺細胞Glu的釋放和細胞膜的完整性；比色法檢測去除細胞外胱氨酸和L-HCA對LPS所致A549細胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）含量的影響，以進一步確定對Xc-的阻斷效應。 3.腹腔注射LPS，觀察Xc-抑制劑L-H

3、CA對小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中Glu濃度的影響，進一步在整體水平論證Xc-在LPS致肺細胞Glu釋放中的作用。 結(jié)果： 1.0.3～100.0ng/ml LPS處理A549細胞8h可以促進Glu的釋放。其中LPS為1.0ng/ml時A549細胞釋放Glu最顯著，且在作用8h時Glu釋放達最大。 2.LPS（1.0ng/ml）分別處理A549、HBEc和HLF-02細胞8h，發(fā)現(xiàn)LPS可促進這三種細胞釋放

4、Glu，其中LPS促進A549細胞釋放Glu最顯著，與對照組相比增加391.5％。 3.同時還測定上述條件培養(yǎng)液中的LDH濃度，與對照組相比無明顯改變，提示在本實驗所用的LPS濃度和作用時間范圍內(nèi)不會對細胞造成損傷，因而不會發(fā)生細胞內(nèi)的Glu非特異釋放。 4.RT-PCR證實Xc-的輕鏈xCT和重鏈4F2hc mRNA在A549、HBEc和HLF-02細胞均呈陽性表達，正常情況下，HLF-02細胞xCT mRNA表達最明

5、顯，HBEc細胞的4F2hc mRNA表達最強。A549細胞Xc-的輕鏈和重鏈mRNA在LPS處理后表達增強最為明顯。 5.A549、HBEc和HLF-02細胞應用L-HCA（0.9mg/ml）預處理30min，再加入LPS作用8h，Glu釋放均明顯受到抑制。而單用L-HCA對各細胞的Glu釋放沒有影響。同時證實LPS能夠促進A549細胞合成GSH，但在L-HCA干預后GSH的合成顯著抑制。用無胱氨酸培基替代正常培基LPS不再能

6、促進A549細胞釋放Glu和合成GSH。 6.LPS（10.0mg/kg）處理小鼠6h能明顯增加BALF中Glu濃度，而L-HCA（4.5mg/kg）預處理30min，BALF中Glu濃度顯著降低，與LPS組比較存在顯著性差異。 結(jié)論： 1.LPS可促進不同肺細胞釋放Glu，且呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴性。 2.本研究證實肺的不同種類細胞HBEc、A549和HLF-02上均存在xCT和4F2hc mRNA表

7、達，說明Xc-在肺內(nèi)不同細胞普遍表達。并且還首次發(fā)現(xiàn)Xc-介導LPS所致肺細胞Glu的釋放過程。 第二章脂多糖促進A549細胞釋放谷氨酸機制的初步探討。 目的：初步探討LPS促進A549細胞Glu釋放的機制，為急性肺損傷的治療提供新的靶點。 方法： 1.以A549為研究對象，初步探討LPS促進肺釋放Glu的機制。分別觀察Ca2+螯合劑（EGTA）、基因表達抑制劑放線菌素D（actinomycin，ActD）和

8、一氧化氮合酶抑制劑（L-NAME）預處理后對LPS致其釋放Glu濃度的變化，以探討細胞外Ca2+、基因轉(zhuǎn)錄和NO在調(diào)節(jié)LPS所致肺細胞釋放Glu中的相關(guān)關(guān)系。 2.細胞內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）等與Glu合成相關(guān)酶的活性采用生化方法測定，L-谷氨酸脫氫酶（L-GDH）的含量采用ELISA測定，培養(yǎng)基中NO測定采用硝酸還原酶法測定。 3.xCT、4F2hc、GOT和L-GDH mRNA的表達采用實時熒光定

9、量PCR進行檢測。 結(jié)果： 1.應用ActD（3.5μg/ml）預處理A549細胞30min后加入LPS（1.0ng/ml）繼續(xù)培養(yǎng)8h，發(fā)現(xiàn)A549細胞Glu的釋放明顯受到抑制。而EGTA（18.7mg/ml）預處理A549細胞30min，則不能抑制LPS所致A549細胞釋放Glu。 2.1.0ng/ml的LPS不能引起A549細胞NO釋放的改變，并且未觀察到一氧化氮合酶抑制劑（L-NAME）預處理對LPS所致

10、A549細胞釋放Glu增加的影響。 3.為了解LPS對肺細胞Glu合成相關(guān)酶的影響，本實驗觀察了A549細胞內(nèi)GOT、GPT的活性和L-GDH的含量變化。發(fā)現(xiàn)LPS增強GOT的活性并可提高L-GDH的含量，但對GPT的活性沒有影響。 3.實時熒光定量PCR顯示LPS上調(diào)A549細胞xCT、4F2hc、GOT和L-GDH mRNA的表達水平。 結(jié)論： 1.本實驗證實LPS促進A549細胞Glu的釋放并上調(diào)x

11、CT、4F2hc、L-GDH和GOT mRNA的表達，而mRNA合成抑制劑ActD能明顯抑制LPS所致的A549細胞Glu的釋放。提示LPS促進A549細胞Glu釋放的機制有賴于基因轉(zhuǎn)錄的過程。 2.LPS所致A549細胞釋放Glu增多可能與Glu合成相關(guān)酶GOT的活性增強及L-GDH含量增高有關(guān)。 3.本實驗首次證實細胞外Ca2+不參與LPS引起的A549細胞釋放Glu。 4.本實驗首次證實NO不參與低濃度LP