中樞Ⅰ型囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運體表達與學習記憶功能關系的初步研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以認知功能障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，由于其發(fā)病機理復雜，加之腦內(nèi)所形成的病理改變逆轉(zhuǎn)十分困難，因此，給臨床治療和防治AD藥物的研究與開發(fā)帶來了極大的困難，至今尚無理想的治療藥物問世。由于AD屬于多基因復雜性疾病，多種基因及其表達產(chǎn)物在其中樞認知功能障礙發(fā)生的病理生理過程中具有重要調(diào)控作用。因此，研究、闡明這些重要調(diào)控基因的功能對于揭示AD的發(fā)病機理以及防治AD藥物靶標的

2、發(fā)現(xiàn)和研究均具有重要意義。 囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運體(Vesicular glutamate transporter,VGLUT)是神經(jīng)元囊泡谷氨酸遞質(zhì)的轉(zhuǎn)運體，目前有3種類型被鑒定。其中VGLUIT1主要在神經(jīng)元富集區(qū)如大腦皮層和海馬中表達，并選擇性地位于興奮性谷氨酸能神經(jīng)元突起末端的突觸囊泡上，擔負著將囊泡外谷氨酸運輸進突觸囊泡內(nèi)，并在突觸中調(diào)節(jié)這種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及在后續(xù)生理過程中的重要功能，是谷氨酸能神經(jīng)元及其軸突末端高度特

3、異的標志物。VGLUT1表達水平的變化對于谷氨酸突觸傳遞的效能具有重要影響，其表 達水平則反應了谷氨酸能神經(jīng)元及其突觸的數(shù)目、活動度以及功能狀態(tài)。但VGLUT1的表達與學習記憶功能的關系尚不十分清楚。本室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，給予12月齡快速老化模型小鼠SAMP8連續(xù)口服石杉堿甲和六味地黃湯4周，其海馬VGLUT1的表達發(fā)生了明顯改變，提示AD治療藥物石杉堿甲和具有益智作用的中藥復方六味地黃湯對學習記憶功能的影響與調(diào)節(jié)海馬VGLUT

4、1的表達具有一定關系。 快速老化模型小鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)的快速老化亞系SAM-prone/8，SAMP8)的典型特征是隨增齡呈現(xiàn)學習記憶功能障礙，腦內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)元丟失、Aβ沉積等類似AD的病理改變及多種基因的表達異常，是在基因和蛋白水平研究AD的良好模型。為揭示VGLUT1與學習記憶功能的相關性，探索其做為防治AD藥物篩選靶標的可能性，并為后續(xù)研究積累實驗依據(jù)，本研究以SAM

5、P8為模型，采用實時定量PCR和Western-blot以及免疫組化技術，首先觀察了SAMP8增齡過程中海馬和皮層VGLUT1表達和分布變化，以探討其在學習記憶功衰退過程中表達變化的規(guī)律；進而采用穿梭箱實驗，觀察了VGLUT1的表達與小鼠在條件性回避反應實驗過程中與學習記憶獲得的關系；在此基礎上，觀察了對AD病人或模型動物具有良好療效、但功能主治不同的中藥復方六味地黃湯(LW)、八味地黃湯(BW)、黃連解毒湯(HL)、調(diào)心方(TXF)和

6、當歸芍藥散(DSS)，以及目前臨床用于AD治療的藥物石杉堿甲，對VGLUT1基因和蛋白表達的影響，以探討其對防治AD藥物的反應性。 一、快速老化模型小鼠增齡過程中海馬及皮層VGLUT1表達和分布的變化 SAMP8的典型特征是認知功能呈增齡性衰退，為了揭示VGLUT1是否與增齡性認知功能衰退相關，本研究采用實時定量PCR和Western-blot以及免疫組化技術，觀察了SAMP8在增齡過程中海馬和皮層VGLUT1基因和蛋白

7、的表達變化及分布。 1．APP表達 APP是AD病人腦內(nèi)老年斑主要組成成分Aβ的前體蛋白，已有大量研究表明，APP轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)有明顯學習記憶功能障礙，此外，SAMP8在增齡過程中其腦內(nèi)APP基因和蛋白表達以及β淀粉樣沉積逐漸增多。因此，本研究以APP表達為對照，首先觀察了SAMP8在增齡過程海馬和皮層APP基因和蛋白表達的變化。結(jié)果表明，SAMR1海馬和皮層中APP基因和蛋白的表達隨增齡無明顯改變，而SAMP8海馬和皮

8、層APP基因和蛋白表達則隨增齡逐漸升高；與同月齡SAMR1相比，APP基因和蛋白在2月齡SAMP8海馬和皮層中的表達無變化，但在6和12月齡其表達均明顯高于同齡SAMR1對照組。 2．VGLUT1表達和分布的變化 本研究結(jié)果表明，隨著月齡的增加，SAMR1海馬和皮層VGLUT1的基因和蛋白表達無明顯改變。而SAMP8海馬和皮層VGLUT1的表達則呈現(xiàn)出與SAMR1不同的變化規(guī)律，表現(xiàn)為先降低后升高，呈珊‘V’字曲線。

9、即在2月齡時其表達與同齡SAMRl相比無明顯改變，6月齡時表達明顯低于2月齡及同齡SAMR1，12月齡時表達則恢復至接近2月齡水平，且與同齡SAMR1相比無明顯差異。免疫組化觀察結(jié)果表明，VGLUT1主要存在于皮層、海馬神經(jīng)元的胞質(zhì)與胞膜中，尤其是海馬齒狀回中分布較多。VGLUT1基因和蛋白在SAMRl和SAMP8海馬和皮層中的增齡性表達變化規(guī)律是相同的，即SAMR1海馬和皮層VGLUT1中分布隨增齡無明顯改變；SAMP8在2月齡時其表

10、達與同齡SAMR1相比無明顯改變，6月齡時表達明顯低于2月齡及同齡SAMR1，12月齡時表達則恢復至接近2月齡水平，與同齡SAMR1相比亦無明顯差異。 二、VGLUT1表達與小鼠學習記憶獲得的關系 為進一步研究VGLUT1表達與學習記憶功能的關系，本研究應用反映動物條件性回避反應學習記憶行為能力的穿梭箱實驗，觀察了VGLUT1表達與小鼠學習記憶獲得的關系。實驗選用雄性小鼠，連續(xù)實驗6天。于實驗第6天結(jié)束后根據(jù)學習成績優(yōu)劣

11、分成6組，并以未進行學習行為實驗小鼠為對照。然后觀察了其海馬和皮層APP和VGLUT1基因和蛋白的表達的改變，以探討VGLUT1表達與學習記憶獲得的關系。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，海馬和皮層VGLUT1基因和蛋白表達量均與學習記憶成績呈明顯正相關關系，提示VGLUT1可能參與了學習記憶的生理過程。 三、益智中藥復方和石杉堿甲對SAMP8海馬和皮層VGLUT1表達的影響 已有臨床研究結(jié)果表明，當歸芍藥散、調(diào)心方、黃連解毒

12、湯等中藥復方對AD病人具有良好的治療效果；大量實驗藥理學研究結(jié)果表明，六味地黃湯、八味地黃湯等對多種原因所致動物學習記憶功能障礙具有明顯改善作用，這些中藥復方的功效是不同的。石杉堿甲為臨床常用的AD治療藥物。為觀察VGLUT1對上述藥物的反應性，本研究選用12月齡SAMP8，分別灌胃給予六味地黃湯(10g/kg)、八味地黃湯(10.5g/kg)、當歸芍藥散(3.4g/kg)、調(diào)心方(34.7 g/kg)、黃連解毒湯(5 g/kg)和石杉

13、堿甲(5×10<'-6>g/kg)，連續(xù)5周。采用實時定量PCR和Western-blot技術，觀察了SAMP8海馬及皮層APP和VGLUT1基因和蛋白的表達變化。結(jié)果表明，與同齡SAMR1相比，SAMP8給水模型組海馬VGLUT1基因和蛋白表達均明顯升高，皮層VGLUT1表達水平與SAMR1對照組無明顯差異；SAMP8海馬和皮層APP表達則均較SAMR1對照組明顯升高。給予中藥復方和石杉堿甲處理后，SAMP8海馬和皮層VGLUT1基因

14、和蛋白表達均降低，其中除黃連解毒湯組外，其它各給藥組與SAMP8對照組相比均具有統(tǒng)計學差異。藥物處理組SAMP8海馬和皮層APP基因和蛋白表達的結(jié)果與VGLLUT1相似，給藥后均下降，在海馬中除當歸芍藥散外，其它給藥組與對照組相比均具有統(tǒng)計學差異。 以上結(jié)果表明，海馬和皮層VGLUT1的表達隨中樞學習記憶功能的衰退和學習記憶的獲得而發(fā)生規(guī)律性變化，提示海馬和皮層VGLUT1與中樞學習記憶功能具有密切關系，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常學習記憶

15、功能的維持或調(diào)節(jié)過程。在本文的撰寫過程中，我們發(fā)現(xiàn)今年4月Neurobiolgy of Aging上于網(wǎng)上刊出了一篇定稿文章，該文報道了AD病人前腦皮層VGLUT1表達明顯降低，且與AD病人的認知功能低下的程度呈正相關。該研究結(jié)果支持本研究所作出的結(jié)論。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，SAMP8給予益智藥物后，其海馬和皮層VGLUT1表達明顯下調(diào)，提示其對益智藥物治療具有良好的反應性，通過調(diào)節(jié)VGLUT1的表達可能是上述益智藥物發(fā)揮益智作用的途徑之一

16、。因此，有理由認為，VGLUT1具有成為防治AD藥物篩選靶標的潛在價值，值得進一步深入研究。 大量研究結(jié)果表明，SAMP8在2月齡時已開始出現(xiàn)學習記憶功能的損害，隨后呈進行性加重，6月齡時已十分明顯，12月齡時更為嚴重。本研究結(jié)果表明，SAMP8在增齡過程中海馬和皮層VGLUT1的表達變化曲線呈“V”字型，即在2月齡時與同齡SAMR1無明顯差異，6月齡時表達明顯下調(diào)，隨后又升高，12月齡時達到2月齡水平，與同齡SAMR1相比亦無