腦缺血預(yù)處理對海馬CA1區(qū)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1a mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的:近年來,隨著人口老齡化,腦缺血性疾病的發(fā)病呈上升趨勢,其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率不僅嚴(yán)重危害患者的健康和生活質(zhì)量,同時(shí)在腦缺血性疾病中,神經(jīng)元對缺血性損害極為敏感,經(jīng)過一定時(shí)間的缺血后,神經(jīng)元會(huì)大量死亡,此時(shí)即使恢復(fù)血液供應(yīng),神經(jīng)元亦難以再生,仍然會(huì)給患者留下嚴(yán)重的后遺癥。因此,如何提高神經(jīng)元對缺血性損傷的抵抗力和耐受力,使其在蒙受較嚴(yán)重的缺血打擊時(shí)減輕損傷、保持存活,以保證恢復(fù)血液供應(yīng)后這些神經(jīng)元仍能具有正常功能,對腦缺血性

2、疾病的治療具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),嚴(yán)重腦缺血后,海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元大量死亡。若預(yù)先給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物輕微,不至于引起神經(jīng)元損傷的腦缺血,則可以保護(hù)神經(jīng)元,使其能夠耐受其后的通常會(huì)引起神經(jīng)元損傷的較嚴(yán)重的腦缺血。這一現(xiàn)象被稱為腦缺血耐受;預(yù)先給予的輕微、短時(shí)的腦缺血稱為腦缺血預(yù)處理。研究腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的產(chǎn)生機(jī)制,并據(jù)此探索、開發(fā)提高神經(jīng)元對缺血性損害的耐受能力的方法,可以為臨床上腦缺血性疾病的治療提

3、供新思路。
　　 早在1984年,谷氨酸(glutamic acid,Glu)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)就已經(jīng)被廣泛接受。目前認(rèn)為Glu是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。研究證實(shí),腦缺血時(shí)細(xì)胞外液谷氨酸等興奮性氨基酸的濃度異常升高。這些興奮性氨基酸與突觸后膜或突觸前膜的離子型或代謝型谷氨酸受體結(jié)合后,可產(chǎn)生神經(jīng)毒效應(yīng)。降低腦缺血時(shí)細(xì)胞外液中谷氨酸濃度,是防治其興奮性毒性作用、減輕缺血性神經(jīng)元損傷的重要手段。由

4、于細(xì)胞外沒有谷氨酸代謝酶,中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外的谷氨酸的代謝主要依靠興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(excitatory amino acid transports,EAATs)來維持。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體可以轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外的谷氨酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并降低谷氨酸在突觸間隙的濃度。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在及時(shí)終止突觸傳遞以及防止谷氨酸受體過度興奮中均發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)5種EAATs,分別是EAAT1(GLAST)、EAAT2(GLT-1)、EAAT3(EAAC1

5、)、EAAT4和EAAT5。一般認(rèn)為,星型膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取能力遠(yuǎn)大于神經(jīng)元,而GLAST和GLT-1為膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體,主要分布在星型膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 既往實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明腦缺血預(yù)處理(cerebralischemic preconditioning,CIP)可使星型膠質(zhì)細(xì)胞突起延長,環(huán)繞錐體神經(jīng)元,同時(shí)表達(dá)大量的GLT-1,并使其對谷氨酸的攝取增強(qiáng);損傷性腦缺血可致海馬CA1區(qū)GLT-1表達(dá)下調(diào),尤其死亡的錐體細(xì)胞周圍下調(diào)更為

6、明顯,甚至表現(xiàn)為大片的GLT-1表達(dá)缺失;應(yīng)用GLT-1抑制劑(dihydrokainate,DHK)、或應(yīng)用GLT-1的反義寡核苷酸減少GLT-1的表達(dá),均可抑制腦缺血預(yù)處理的腦保護(hù)作用。這些研究結(jié)果表明GLT-1確實(shí)參與腦缺血預(yù)處理所誘導(dǎo)的腦缺血耐受。
　　 最近有研究報(bào)道,GLT-1存在剪接變異體。根據(jù)其羧基端不同,GLT-1存在四種剪接變異體,其中3種為C末端剪接變異體,分別被命名為GLT-1a(GLT-1a)、GLT-

7、1b(GLT-1v)以及GLT-1c(Rauen et al2004)。1種為N末端剪接變異體(rGLT-1A)(Rozyczka and Engele2005)。其中,GLT-1c在大鼠腦組織中表達(dá)量很低,GLT-1a和GLT-1b在大鼠的腦組織中表達(dá)豐富。GLT-1a在海馬當(dāng)中的表達(dá)占總GLT-1的90％左右。既往研究發(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦缺血缺氧的情況下GLT-1的剪接變異體的表達(dá)可發(fā)生變化,但究竟是何種類型的剪接變異體在腦缺血耐受誘

8、導(dǎo)過程中發(fā)揮作用,目前尚未見到任何相關(guān)報(bào)道。鑒于GLT-1a和GLT-1b在大鼠的腦組織中表達(dá)豐富,本課題擬主要觀察GLT-1a在腦缺血耐受誘導(dǎo)中的作用。
　　 方法:
　　 健康雄性Wistar大鼠(260～300g)96只,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1～2d以適應(yīng)環(huán)境,然后用于實(shí)驗(yàn)。除了control組外,將凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈的Wistar大鼠隨機(jī)分組。具體如下:(1)Sham組(n=24):只暴露雙側(cè)

9、頸總動(dòng)脈,不阻斷血流;(2)腦缺血預(yù)處理(cerebral ischemic prcconditioning,CIP)組(n=24):夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3min后恢復(fù)血流灌注;(3)腦缺血打擊(ischemic insult,Ⅱ)組(n=24):夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8min后恢復(fù)血流灌注;(4)腦缺血預(yù)處理+腦缺血打擊(CIP+Ⅱ)組(n=24):夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3min作腦缺血預(yù)處理,后恢復(fù)血流灌注。再灌注2d后,夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8min作

10、為腦缺血打擊,后再恢復(fù)血流灌注;除了control組外,其他各組分別于末次手術(shù)后0min、1h、3h、6h、1d、3d、5d、7d時(shí)取海馬CA1區(qū)(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=3),后應(yīng)用RT-PCR法研究GLT-1a mRNA的表達(dá)數(shù)量。
　　 結(jié)果:
　　 Control組大鼠海馬GLT-1a mRNA有一定表達(dá)。
　　 0min、1h時(shí)間點(diǎn)比較:sham組與Control組相比明顯升高(p＜0.05)。CIP組與Ⅱ組及s

11、ham組相比無顯著差異(p＞0.05)。CIP+Ⅱ組與Ⅱ組相比明顯升高(p＜0.05)。
　　 3h、6h時(shí)間點(diǎn)比較:sham組與Control組相比明顯升高(p＜0.05)。CIP組與sham組相比明顯升高(p＜0.05)。Ⅱ組與sham組相比稍有降低,無顯著差異(p＞0.05)。CIP+Ⅱ組與Ⅱ組相比明顯升高(p＜0.05)。
　　 1d時(shí)間點(diǎn):sham組與Control組相比明顯升高(p＜0.05)。CIP組與sh

12、am組相比明顯升高(p＜0.05)。Ⅱ組與sham組、CIP組及CIP+Ⅱ組相比均明顯降低(p＜0.05)。
　　 3d時(shí)間點(diǎn):sham組與Control組相比稍有升高,無顯著差異(p＞0.05)。CIP組與sham組相比明顯升高(p＜0.05)。Ⅱ組與sham組、CIP組及CIP+Ⅱ組相比均明顯降低(p＜0.05)。
　　 5d、7d時(shí)間點(diǎn)比較:sham組與Control組相比無顯著差異(p＞0.05)。CIP組與sh