電針耐受大鼠下丘腦MIRNA與脊髓谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)研究.pdf

1、電針具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，已廣泛應(yīng)用于多種疾病，特別是疼痛性疾病的治療。在臨床上，人們發(fā)現(xiàn)反復(fù)或持續(xù)電針會引起電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)下降，即電針耐受。電針耐受是針刺治療的一種負(fù)效應(yīng)，引起了臨床工作者和研究人員的極大關(guān)注。大量的研究表明電針在誘導(dǎo)阿片物質(zhì)（腦啡肽、內(nèi)啡肽等）釋放，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛的同時(shí)，可引起抗阿片物質(zhì)（如膽囊收縮素、孤啡肽、血管緊張素II等）的釋放增加。盡管這些研究闡明了這些活性物質(zhì)的作用及其相互間的關(guān)系，電針耐受的機(jī)制仍不清楚。研究表明電

2、針與嗎啡有交叉耐受現(xiàn)象。人們在研究嗎啡耐受時(shí)發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)與興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT)均參與嗎啡耐受。然而，miRNA和EAAT是否參與電針耐受尚無報(bào)道。因此，本研究旨在探索miRNA與EAAT在電針耐受中的作用。
　　1.電針耐受大鼠模型的建立
　　篩選單次電針后痛閾升高50％的SD大鼠（有效鼠）用于正式實(shí)驗(yàn)。將60只有效鼠（250±20 g）隨機(jī)分為3組，每組20只:電針組，對照組和假針組。電針組

3、大鼠每天電針1次，連續(xù)電針8d;對照組大鼠僅做保定處理;假針組大鼠只扎針、不通電。采用鼠尾光照測痛法測定大鼠痛閾。記錄電針前后的大鼠痛閾，計(jì)算每次電針的痛閾變化率。結(jié)果顯示，對照組與假針組的大鼠痛閾變化率無顯著差異。電針組大鼠的痛閾變化率隨著電針次數(shù)的增加而下降;電針組大鼠的痛閾變化率在第1至6天高于對照組，在第7、8天與對照組無差異。提示電針耐受的形成。
　　2.電針耐受大鼠下丘腦miRNA的差異表達(dá)
　　為探索下丘腦mi

4、RNA在電針耐受中的作用，本研究采取電針耐受大鼠下丘腦進(jìn)行高通量深度測序，運(yùn)用qPCR方法對測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步通過側(cè)腦室微注射技術(shù)對深入研究差異miRNA在電針耐受中的作用。在miRNA深度測序?qū)嶒?yàn)中，選取兩窩雄性有效鼠（250±20 g），每窩6只，共計(jì)12只。將大鼠分為兩組，即電針組和對照組。按照配對實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行同窩配對，每對大鼠中一只接受電針，另一只接受對照處理。電針組大鼠接受每天1次、連續(xù)8d電針。第8天電針后迅速處死，

5、取下丘腦。其中同組同窩的3只大鼠樣品混合為一個(gè)樣品池（即每組樣品兩個(gè)樣品池），進(jìn)行測序建庫。利用高通量深度測序技術(shù)和生物信息學(xué)方法分析電針組與對照組間的miRNA差異表達(dá)，并對差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測和功能富集分析。在qPCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，選取9只雄性有效鼠（250±20 g），隨機(jī)分為3組，即對照組、電針組和假針組，每組3只。電針組大鼠接受每天1次、連續(xù)8d電針。第8天電針后迅速處死，取下丘腦、丘腦、海馬，分別采用qPCR法對差

6、異miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。選取測序結(jié)果中表達(dá)量最高的12個(gè)差異miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。在側(cè)腦室注射驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，選取132只雄性有效鼠（250±20 g），隨機(jī)分為兩組，即電針組與對照組，每組66只。各組大鼠分別接受側(cè)腦室注射4種agomir(ago-7a-5p、ago-204-5p、ago-148a-3p、ago-370-3p),4種antagomir(antago-let-7b-5p、antago-107-3p、antago-124-3p、a

7、ntago-221-3p)，negative agomir，negative antagemir或生理鹽水（每6只大鼠注射同一種藥物）。注射后，電針組大鼠接受每天1次、連續(xù)8d電針，并于每次電針前后測定痛閾，計(jì)算痛閾變化率。
　　MiRNA深度測序結(jié)果顯示:測序分析共得到49個(gè)差異表達(dá)miRNA。電針組中34個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，15個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)。這些差異miRNA可能通過MAPK通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子、脂肪酸代謝等通路，以及

8、神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)、受體信號通路和基因表達(dá)調(diào)節(jié)等生物學(xué)機(jī)制參與電針耐受。進(jìn)一步QPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，電針組大鼠下丘腦中，miR-124-3p、miR-221-3p、miR-let-7b-5p和miR-107-3p上調(diào)(p＜0.05)，miR-7a-5p、miR-148a-3p、miR-204-5p、miR-370-3p、miR-434-5p和miR-344b-3p下調(diào)(p＜0.05)，與高通量測序結(jié)果基本一致，印證了測序結(jié)果的可靠性。電針組大

9、鼠丘腦中，5個(gè)miRNA上調(diào)(p＜0.05)，4個(gè)miRNA下調(diào)(p＜0.05)。電針組大鼠海馬中，5個(gè)miRNA上調(diào)(p＜0.05)，2個(gè)miRNA下調(diào)(p＜0.05)。這些miRNA在不同部位表達(dá)水平有所差異，提示在電針耐受過程中，miRNA的表達(dá)存在區(qū)域特征。側(cè)腦室注射實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示:電針組中，注射agomir-148a-3p的大鼠在4～8 d、注射agomir-370-3p的大鼠在6～8 d、注射antagomir-let-7b

10、和antagomir-107-3p的大鼠在3～8 d，以及注射antagomir-124-3p的大鼠在2d和6～8 d的痛閾變化率高于(p＜0.05)電針+生理鹽水組，提示miR-148a-3p、miR-370-3p、let-7b-5p、miR-107-3p以及miR-124-5p參與電針耐受。
　　3.電針耐受大鼠脊髓谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)時(shí)程變化
　　為探索脊髓EAAT在電針耐受中的作用，本研究采用qPCR和western

11、blot方法檢測電針耐受過程中脊髓EAAT的動(dòng)態(tài)表達(dá)，并通過鞘內(nèi)注射EAAT激動(dòng)劑（利魯唑），觀察EAAT活性增強(qiáng)后對電針耐受的影響。為確定電針后的最佳采樣時(shí)間，本研究先測定了單次電針后的脊髓EAAT表達(dá)時(shí)程。選取36只有效鼠（250±20 g）進(jìn)行單次電針，分別于電針前(0 h)和電針后0.5、1、2、4、8h采取脊髓I4-5段，檢測三種脊髓EAAT的動(dòng)態(tài)表達(dá)，包括L-谷氨酸-L門冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST)，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLT-1

12、)和興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(EAAC1)。并將其表達(dá)峰值時(shí)間點(diǎn)作為后續(xù)采樣時(shí)間點(diǎn)的依據(jù)。為探索反復(fù)電針對脊髓谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)時(shí)程的影響，選取120只有效鼠（250±20 g），隨機(jī)分兩組，即電針組與假針組，每組60只。電針組大鼠接受每天1次、連續(xù)8d電針，并于電針前后測定痛閾，計(jì)算痛閾變化率。各組大鼠隨機(jī)選取12只，分別于電針前(0 d)和電針后2、4、6、8d采取脊髓L4-5段，檢測EAAT表達(dá);其中6只大鼠在電針后2h采樣，用于檢測G

13、LAST與GLT-1的表達(dá);另6只在電針后4h采樣，用于檢測EAAC1的表達(dá)。為探索鞘內(nèi)注射利魯唑（EAAT激動(dòng)劑）對電針耐受的影響，選取36只有效鼠，隨機(jī)分為6組:電針+溶劑組、電針+5μg利魯唑組、電針+10μg利魯唑組、電針+20μg利魯唑組、溶劑組、20μg利魯唑組，每組6只大鼠。其中電針組大鼠接受每天1次、連續(xù)8d電針;利魯唑處理組的大鼠在每次電針前注射利魯唑。每日電針前后測定大鼠痛閾，并計(jì)算痛閾變化率。
　　單次電針的

14、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0h相比，GLAST與GLT-1的基因表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)無顯著變化，而蛋白表達(dá)在2、4和8h升高，并于4h達(dá)到峰值。EAAC1的基因表達(dá)在電針后1、2、4、和8h升高，蛋白表達(dá)在2、4和8h升高，并于2h達(dá)到表達(dá)峰值。因此，在反復(fù)電針實(shí)驗(yàn)中，檢測GLAST與GLT-1的樣品在電針后4h采取，而檢測EAAC1的樣品在電針后2h采取。反復(fù)電針的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GLAST與GLT-1的基因表達(dá)與假針組相比無顯著差異，而EAAC1的基

15、因表達(dá)在第2、4天高于假針組，第8天低于假針組。三種脊髓EAAT的蛋白表達(dá)均隨電針次數(shù)的增加而下降，并與痛閾變化率呈正相關(guān)。至第8天時(shí)，三種脊髓EAAT的蛋白表達(dá)與假針組無差異。進(jìn)一步的鞘內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針+20μg利魯唑組的痛閾變化率在第4～8天高于電針+溶劑組，電針+10μg利魯唑組的大鼠痛閾變化率在第5～8天高于電針+溶劑組，而電針+5μg利魯唑組的大鼠痛閾變化率與電針+溶劑組無顯著差異。提示鞘內(nèi)注射利魯唑可劑量依賴性地部分