腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT-1b mRNA的表達.pdf

1、目的：腦缺血性疾病是嚴重危害著當(dāng)代人類健康的常見疾病。眾所周知，大腦神經(jīng)元對缺血性損害極為敏感，經(jīng)過一定時間的缺血后，神經(jīng)元會大量死亡，因此如何提高神經(jīng)元對缺血性損害的抵抗力，以保證積極疏通血管、恢復(fù)血流供應(yīng)后神經(jīng)元仍具有正常功能，具有很重要的現(xiàn)實意義。
　　 實驗發(fā)現(xiàn)，給動物突然造成較嚴重的腦缺血后，海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元會大量死亡。若在此以前，預(yù)先給動物造成輕微、短時、不至于引起神經(jīng)元死亡的腦缺血，間隔一定時間后，再給此動物造

2、成較嚴重的會引起大量神經(jīng)元死亡的腦缺血，此時海馬CA1區(qū)神經(jīng)元基本不死亡，即神經(jīng)元對缺血性損害產(chǎn)生了抵抗力。這一現(xiàn)象被稱為腦缺血耐受，預(yù)先給予的輕微、短時腦缺血稱為腦缺血預(yù)處理。
　　 谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，由于胞外沒有谷氨酸代謝酶，中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞外液中谷氨酸的穩(wěn)態(tài)主要由興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體來維持。生理情況下，EAATs轉(zhuǎn)運細胞外的谷氨酸進入細胞內(nèi)，降低其在突觸間隙的濃度，在及時終止突觸傳遞以及

3、防止谷氨酸受體過度興奮中發(fā)揮重要作用。到目前為止，發(fā)現(xiàn)并克隆了5種高親和性EAATs即GLAST、GLT-1、EAAC1、EAAT4和EAAT5。盡管在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞上都存在EAATs，但是星形膠質(zhì)細胞對谷氨酸的攝取能力遠遠高于神經(jīng)元，而且在很多腦區(qū)最主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運體是EAAT2。腦缺血時，細胞外液中的谷氨酸等興奮性氨基酸濃度異常升高，從而造成細胞損傷，因而其又被稱為興奮性神經(jīng)毒素。如何降低腦缺血時細胞外液谷氨酸濃度，以減輕對神

4、經(jīng)元的損傷，是目前研究的熱點之一。
　　 我們的前期實驗已經(jīng)證明，腦缺血預(yù)處理可使星形膠質(zhì)細胞突起延長，并且緊緊環(huán)繞錐體神經(jīng)元，同時表達大量的GLT-1，并使谷氨酸的攝取增強；損傷性缺血可導(dǎo)致GLT-1表達下調(diào)，尤其在死亡的錐體細胞周圍下調(diào)的最為明顯，甚至表現(xiàn)為大片的GLT-1表達缺失；應(yīng)用GLT-1抑制劑DHK抑制GLT-1的功能、或應(yīng)用GLT-1的反義寡核苷酸減少GLT-1的表達，均可抑制腦缺血預(yù)處理的腦保護作用。這些研究結(jié)

5、果表明，GLT-1參與整體情況下腦缺血預(yù)處理所誘導(dǎo)的腦缺血耐受。
　　 最近有研究報道，GLT-1存在剪接變異體。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)大鼠GLT-1的剪接變異體共有4種，其中3種為C末端剪接變異體，1種為N末端剪接變異體。3種C末端剪接變異體分別被命名為GLT-1a、GLT-1b以及GLT-1c。在大鼠腦組織中GLT-1c表達量很低，不存在于神經(jīng)元，僅僅局限于血管周圍的星形膠質(zhì)細胞的終足，以及第三腦室和側(cè)腦室附近的星形膠質(zhì)細胞。G

6、LT-1a和GLT-1b在大鼠的腦組織中表達豐富，包括海馬在內(nèi)的廣泛腦區(qū)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞均表達GLT-1a和GLT-1b。在一些病理情況下，GLT-1的剪接變異體的表達可發(fā)生變化。但是究竟GLT-1的何種剪接變異體在腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中發(fā)揮作用還不清楚。所以我們欲探討GLT-1b在腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中是否發(fā)揮作用。
　　 方法：健康雄性Wistar大鼠135只，體重280-320g，隨機分為5組。除control組之外，其

7、余大鼠均首先永久凝閉椎動脈，恢復(fù)2天后，進行sham手術(shù)或腦缺血處理，具體分組如下：①control組；②sham組：只暴露雙側(cè)頸總動脈，不阻斷血流；③腦缺血預(yù)處理組：夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min后恢復(fù)再灌注；④損傷性缺血組：夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min后恢復(fù)再灌注；⑤腦缺血預(yù)處理+損傷性缺血組：夾閉雙側(cè)頸總動脈3min作為腦缺血預(yù)處理，再灌2天后，再次夾閉雙側(cè)頸總動脈8min作為損傷性缺血，然后恢復(fù)再灌注。除control組之外，其余各組

8、分別于末次手術(shù)后0min、30min、1h、3h、6h、1d、2d、3d、5d、7d時取海馬腦組織。左側(cè)海馬制成5 μm厚的石蠟切片用于以下實驗：1 硫堇染色進行神經(jīng)病理學(xué)評價；2 原位雜交檢測GLT-1b mRNA的表達。右側(cè)海馬通過RT-PCR法觀察GLT-1b mRNA的表達數(shù)量。
　　 結(jié)果：
　　 1 神經(jīng)病理學(xué)評價
　　 硫堇染色顯示，control組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列整齊致密，可見2～3

9、層，細胞形態(tài)完整、邊界清晰、尼氏小體豐富，胞核大而圓、核仁清晰，ND為203±9.7。Sham組大鼠各時間點海馬CA1區(qū)均未見明顯損傷，與control組相比，ND均無明顯變化。CIP組大鼠在各時間點海馬CA1區(qū)均未見明顯損傷，與sham組相應(yīng)時間點相比，ND均無明顯變化。II組在2天內(nèi)未見明顯的錐體神經(jīng)元損傷；至損傷性腦缺血后5 d和7 d時，神經(jīng)元幾乎全部死亡，與sham組相比，ND明顯減少。CIP+II組在各時間點海馬CA1區(qū)錐體

10、細胞排列整齊致密，胞核飽滿，核仁較清晰，僅個別錐體細胞胞核固縮，無明顯細胞缺失，與損傷性腦缺血后7 d組相比，ND明顯升高。這些結(jié)果表明，CIP對2天后發(fā)生的嚴重腦缺血再灌注損傷有明顯的對抗作用，表明腦缺血耐受誘導(dǎo)成功。
　　 2 原位雜交法觀察GLT-1b mRNA在海馬CA1區(qū)的表達
　　 GLT-1b mRNA原位雜交染色顯示形態(tài)完整的錐體神經(jīng)元。Control組海馬CA1區(qū)，神經(jīng)元呈圓形，形態(tài)完整，邊界隱約可見，

11、胞漿著色，呈棕色，胞核基本不著色。
　　 Sham組錐體神經(jīng)元胞漿著色明顯，呈棕色，胞核在0min～6h著色較淺，其余時間點不著色。與control組相比，在0min、30min、1h、3h、6h、12h時間點GLT-1b mRNA表達的平均光密度、陽性標(biāo)記物總面積均明顯升高(P<0.05)；其余時間點GLT-1b mRNA表達的平均光密度、陽性標(biāo)記物總面積均無明顯差異。
　　 CIP組神經(jīng)元著色進一步加深，以3h、6h

12、、12h較為突出，多數(shù)神經(jīng)元幾乎呈均勻一致的棕色，胞核與胞漿的界限不清；2d時間點，胞漿著色仍較深，但胞核基本不著色；此后神經(jīng)元著色逐漸變淺。與sham組相比，GLT-1b mRNA表達的平均光密度在1h、3h、6h、12h、1d、2d時明顯升高，陽性標(biāo)記物總面積在3h、6h、12h、1d、2d明顯升高，其余時間點無明顯差異。
　　 II組早期CA1區(qū)錐體神經(jīng)元形態(tài)無明顯改變，但神經(jīng)元染色逐漸變淺；5d、7d 時，錐體神經(jīng)元幾乎

13、完全消失，在錐體神經(jīng)元區(qū)出現(xiàn)膠質(zhì)細胞侵潤，該細胞較神經(jīng)元體積小，呈圓形，染為棕色。與sham組相比，GLT-1b mRNA表達的平均光密度、陽性標(biāo)記物總面積在12h、1d、2d時均明顯降低。
　　 CIP+II組，早期神經(jīng)元染色明顯加深，胞核與胞漿的界限不清，在3h時間點最為突出；2d時神經(jīng)元染色以胞漿著色為主；此后神經(jīng)元著色逐漸變淺。與II組相比，GLT-1b mRNA表達的平均光密度、陽性標(biāo)記物總面積均明顯升高。
　　

14、 3 RT-PCR法觀察GLT-1b mRNA在大鼠海馬CA1區(qū)的表達數(shù)量
　　 Control組大鼠海馬GLT-1b mRNA有一定量表達。
　　 0min、30min時間點：sham組與control組相比明顯升高；CIP組和II組與sham組相比無明顯差異；CIP+II組與II組相比明顯升高。
　　 1h、3h時間點：sham組與control組相比明顯升高(p<0.05)；CIP組與sham組相比明顯升

15、高(p<0.05)；II組與sham組相比略有降低，但差異無顯著性(P>0.05)；CIP+II組與II組相比明顯升高(p<0.05)。
　　 6h時間點：sham組與control組相比明顯升高(p<0.05)；CIP組與sham組相比明顯升高(p<0.05)；II組與sham組相比無明顯差異 (p>0.05)；CIP+II組與II組相比明顯升高(p<0.05)。
　　 12h、1d時間點：sham組與control組

16、相比明顯升高(p<0.05)；CIP組與sham組相比明顯升高(p<0.05)；II組與sham組及CIP組相比均明顯降低(p<0.05)；CIP+II組與II組相比明顯升高(p<0.05)。
　　 2d時間點：sham組與control組相比無明顯差異(p＞0.05)；CIP組與sham組相比明顯升高(p<0.05)；II組與sham組及CIP組相比均明顯降低(p<0.05)；CIP+II組與II組相比明顯升高(p<0.05)

17、。
　　 3d、5d、7d時間點：sham組與control組相比無明顯差異(p＞0.05)；CIP組與sham組相比無明顯差異(p＞0.05)；II組與sham組及CIP組相比均明顯降低(p<0.05)；CIP+II組與II組相比均明顯升高(p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1 8 min全腦缺血可以導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)大量錐體神經(jīng)元發(fā)生明顯DND，而提前2天的3 min缺血預(yù)處理可以保護錐體神經(jīng)元，使其能

18、夠耐受通常會引起明顯DND的8 min損傷性缺血。
　　 2 原位雜交顯示，缺血預(yù)處理可使大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元GLT-1b mRNA表達增多；RT-PCR顯示，缺血預(yù)處理可使大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1b mRNA表達數(shù)量明顯增多。該變化可能保護錐體神經(jīng)元使其能夠耐受隨后的損傷性缺血打擊，參與缺血預(yù)處理的腦保護作用。
　　 3 CIP+II組與II組相比，原位雜交顯示大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元GLT-1b mRNA表