腦缺血預(yù)處理增強(qiáng)大鼠海馬CA1區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1的結(jié)合特性及其對(duì)谷氨酸的攝取.pdf

1、目的：谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)作用于一系列的興奮性氨基酸受體在神經(jīng)元通信以及神經(jīng)病理性損傷方面發(fā)揮重要作用。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體是調(diào)控腦內(nèi)細(xì)胞外液谷氨酸濃度的重要機(jī)制，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（Glial glutamate transporter-1，GLT-1）在終止谷氨酸能神經(jīng)傳遞，維持細(xì)胞外液谷氨酸濃度處于正常水平方面發(fā)揮重要作用。
　　 本室研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦缺血耐受模型中，腦

2、缺血預(yù)處理（cerebral ischemic preconditioning，CIP）可抑制全腦缺血打擊引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡（delayed neuronal death，DND），同時(shí)上調(diào)海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)、降低腦缺血打擊后海馬CA1區(qū)細(xì)胞外液中的谷氨酸濃度，并且DHK（GLT-1的特異性抑制劑）和GLT-1的反義寡核苷酸則能劑量依賴性的阻斷CIP對(duì)神經(jīng)元的這種保護(hù)作用。這些結(jié)果提示，GLT-1在CIP

3、腦保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
　　 但是，在CIP誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中，GLT-1轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，包括與谷氨酸的結(jié)合特性以及對(duì)谷氨酸的攝取是否發(fā)生變化，尚未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用腦組織病理學(xué)方法、放射性配基結(jié)合方法、L-3H-glutamate標(biāo)記法，在確定CIP誘導(dǎo)腦缺血耐受的基礎(chǔ)上，觀察這一過(guò)程中GLT-1轉(zhuǎn)運(yùn)體的數(shù)量和親和力以及對(duì)谷氨酸的攝取的變化，為闡明GLT-1在腦缺血耐受誘導(dǎo)中的作用提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床上腦

4、血管疾病的防治研究提供新的線索和思路。
　　 方法：200只永久凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈的（Control組大鼠除外）Wistar大鼠（280～300 g）隨機(jī)分為以下5組：
　　 （1）Control組（n=12）：不做任何處理；
　　 （2）Sham組（n=47）：行全腦缺血的sham手術(shù)，即只分離暴露、但不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈。
　　 （3）CIP組（n=47）：全腦缺血3 min作為CIP，之后恢復(fù)腦血液再灌流

5、。
　　 （4）腦缺血打擊組（n=47）：全腦缺血8 min作為腦缺血打擊，之后恢復(fù)腦血液再灌流。
　　 （5）CIP+腦缺血打擊組（n=47）：首先行CIP3 min，恢復(fù)腦血液再灌流2天后，行全腦缺血8 min后恢復(fù)腦血液灌注。
　　 除control組外，以上各組于sham手術(shù)或末次腦缺血再灌注后0 h、1 h、1 d、2 d、3 d、5 d、和7 d取材觀察。其中7 d組動(dòng)物（n=5）用于觀察海馬CA1區(qū)

6、組織病理學(xué)變化；其余各組（n=7）用于GLT-1功能的測(cè)定，其中4只動(dòng)物用于GLT-1的數(shù)量和親和力的測(cè)定，3只動(dòng)物用于GLT-1對(duì)谷氨酸攝取率的測(cè)定。
　　 采用四血管閉塞法制造大鼠全腦缺血模型。首先凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，2天后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈致大鼠全腦缺血；夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min作為CIP，夾閉8 min作為腦缺血打擊；二者都給予時(shí)間隔2d。全腦缺血的sham手術(shù)包括除不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈以外的所有步驟。
　　 海馬CA

7、1區(qū)組織病理學(xué)變化采用常規(guī)組織學(xué)切片、硫堇染色，光鏡下確定組織學(xué)分級(jí)和神經(jīng)元密度，評(píng)價(jià)DND發(fā)生情況。組織學(xué)分級(jí)（histological grade，HG）標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)，無(wú)神經(jīng)元死亡；Ⅰ級(jí)，散在神經(jīng)元死亡；Ⅱ級(jí)，成片神經(jīng)元死亡；Ⅲ級(jí)，幾乎全部的神經(jīng)元死亡。計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目，每張切片雙側(cè)海馬各計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)段取平均數(shù)為神經(jīng)元密度（Neuronal density，ND）。

8、　　 GLT-1的數(shù)量和親和力的測(cè)定采用放射性配基結(jié)合法，分別以Bmax和Kd值表示，以總結(jié)合減去非特異性結(jié)合計(jì)算GLT-1的Bmax和Kd值。Bmax值越大，表明GLT-1的數(shù)量越多；Kd值越小，表明GLT-1對(duì)谷氨酸的親和力越大。對(duì)谷氨酸攝取率的測(cè)定采用3H-標(biāo)記谷氨酸法，以總攝取減去非特異性攝取作為GLT-1對(duì)谷氨酸的攝取。
　　 結(jié)果：
　　 1 CIP減輕全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND
　　

9、 Control組與Sham大鼠海馬CA1區(qū)無(wú)錐體神經(jīng)元死亡，HG均為0級(jí)，ND值分別為208±1.31和198.67±9.35。CIP組大鼠海馬CA1區(qū)組織學(xué)特征與control和sham組大鼠類似，HG為0～Ⅰ級(jí)，ND值為192±18.93。腦缺血打擊組大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的DND，與以上三組相比，HG（Ⅱ～Ⅲ級(jí)）明顯升高（P<0.01），ND值（29.33±13.06）顯著降低（P<0.01）。CIP+腦缺血打擊組海馬CA1

10、區(qū)DND不明顯，與腦缺血打擊組相比，HG（0～Ⅰ級(jí)）明顯降低（P<0.01），ND值（166.67±10.98）顯著升高（P<0.01），表明CIP可以誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生缺血性耐受，對(duì)抗缺血打擊引起的DND。
　　 2 CIP增加大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的數(shù)量和親和力
　　 2.1 Bmax值的變化
　　 與正常control組相比，Sham組Bmax值有一定程度的升高，特別是在sham手術(shù)后1d至3d

11、（P<0.05），表明sham手術(shù)對(duì)GLT-1的數(shù)量有一定影響。CIP組Bmax值明顯升高，2d時(shí)達(dá)到高峰（P<0.05 vs0h、1h和24h），并可持續(xù)至CIP后5d，與sham組同時(shí)間點(diǎn)相比均顯著增加（P<0.05）。腦缺血打擊后Bmax呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，3d時(shí)降至最低（P<0.05 vs0h和1h組）；與sham組相比，腦缺血打擊后0h和1h的Bmax值雖有一定程度的升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而腦缺血打擊后2d、3d和5d組的Bmax值

12、則較sham組同時(shí)間點(diǎn)顯著降低（P<0.05）。CIP+腦缺血打擊組Bmax值變化趨勢(shì)同CIP組，但末次腦缺血后24h即開(kāi)始升高（P<0.05 vs0h和1h組），2d時(shí)達(dá)到高峰，并持續(xù)到全腦缺血后5d；除0h組外，其余各時(shí)間點(diǎn)均較腦缺血打擊組顯著增加（P<0.05）；此外，與CIP組相比，除0h、1h和5d組外，其余各時(shí)間點(diǎn)均顯著增加（P<0.05）。
　　 2.2 Kd值的變化
　　 與control組相比，sham

13、組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的kd值均無(wú)顯著性變化。與sham組相比，CIP后2d的Kd值顯著降低（P<0.05），而腦缺血打擊組的Kd值則有升高趨勢(shì)，尤以腦缺血打擊后2d（P<0.05）最為顯著，至5d時(shí)基本恢復(fù)至sham組水平。而在腦缺血打擊前預(yù)先給予CIP（CIP+腦缺血打擊組），則可明顯抑制腦缺血打擊引起的Kd值的升高，表現(xiàn)為除3d和5d外，其余各時(shí)間點(diǎn)的Kd值均較腦缺血打擊組顯著降低（P<0.05）。
　　 3 CIP提高大鼠海馬C

14、A1區(qū)GLT-1對(duì)谷氨酸的攝取率
　　 與control組相比，Sham組的谷氨酸攝取率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差別。CIP后，谷氨酸的攝取明顯增加（P<0.05），尤以CIP后的早期；隨時(shí)間的推移，谷氨酸的攝取逐漸下降，但5d時(shí)仍高于sham組。腦缺血打擊組谷氨酸的攝取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，以3d時(shí)較為明顯。CIP+腦缺血打擊組谷氨酸的攝取變化趨勢(shì)與CIP組類似，但谷氨酸攝取的增加更加明顯，并且在5d時(shí)仍保持在較高水平。
　　 結(jié)