p38MAPK在腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中大鼠海馬中的表達(dá).pdf

1、目的：MAPKs是一類高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與細(xì)胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶類，是細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核聯(lián)系的關(guān)鍵途徑。研究發(fā)現(xiàn)，MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血及腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中可能發(fā)揮重要作用。p38 MAPK是1993年發(fā)現(xiàn)的MAPK家族的一種亞型，由360個(gè)氨基酸組成的38KDa的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)亞致死量的腦缺血（2分鐘全腦缺血）通過激活p38 MAPK而提高蒙古沙鼠海馬錐體神經(jīng)元的缺血耐受性，使其能夠耐受其

2、通常情況下無法耐受的嚴(yán)重腦缺血（5分鐘的全腦缺血）；p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580能夠劑量依賴性地阻斷2分鐘全腦缺血所誘導(dǎo)的腦缺血耐受。但是，p38 MAPK在腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中的作用及機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。因此，本次實(shí)驗(yàn)旨在探討在體情況下，全腦缺血預(yù)處理中p38 MAPK在海馬中的表達(dá)，為臨床上腦血管疾病的防治研究提供新的線索和依據(jù)。
　　 方法：健康雄性Wistar大鼠160只，體重280-320g，隨即分為4組

3、。所有大鼠均首先永久凝閉椎動(dòng)脈，恢復(fù)2天后，進(jìn)行sham手術(shù)或腦缺血處理，具體分組如下：①sham組（n=40）：只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不阻斷血流；②腦缺血預(yù)處理（cerebral ischemic preconditioning，CIP）組（n=40）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min后恢復(fù)再灌注；③損傷性缺血（ischemic insult，Ⅱ）組（n=40）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min后恢復(fù)再灌注；④腦缺血預(yù)處理+損傷性缺血（CIP+Ⅱ）

4、組（n=40）：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3min作為腦缺血預(yù)處理，再灌2天后，再次夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8min作為損傷性缺血，然后恢復(fù)再灌注。每個(gè)組又根據(jù)末次缺血或手術(shù)后動(dòng)物存活時(shí)間的不同分為8個(gè)時(shí)間點(diǎn)：即刻（0分鐘）、15分鐘、30分鐘、3小時(shí)、1天、2天、4天、7天，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=5。在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，斷頭取海馬腦組織，硫堇染色進(jìn)行神經(jīng)病理學(xué)評價(jià)；免疫組織化學(xué)染色法檢測p-p38 MAPK的表達(dá)。
　　 參照Kato分級方法，于光學(xué)顯微鏡

5、下對海馬CA1區(qū)組織學(xué)改變進(jìn)行分級（Histological grade，HG），標(biāo)準(zhǔn)如下：0級，無神經(jīng)元死亡；1級，散在神經(jīng)元死亡；2級，成片神經(jīng)元死亡；3級，幾乎全部的神經(jīng)元死亡。取雙側(cè)平均等級作為統(tǒng)計(jì)值。高倍鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目，每張切片雙側(cè)海馬各計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)段，取平均數(shù)為神經(jīng)元密度（Neuronal density，ND）。
　　 結(jié)果：
　　 1神經(jīng)病理

6、學(xué)評價(jià)
　　 Sham組大鼠海馬CA1區(qū)，可見錐體神經(jīng)元排列整齊、致密、共2～3層，細(xì)胞形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰。HG為0～Ⅰ級。CIP組，各時(shí)間點(diǎn)錐體神經(jīng)元的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及數(shù)量沒有明顯區(qū)別，海馬CA1區(qū)無明顯的DND，HG為0～Ⅰ級，7d時(shí)ND分別為204±7.21和194.67±8.08。Ⅱ組8 min缺血打擊后，從4d開始海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的DND，7d時(shí)HG為Ⅱ～Ⅲ級、ND為17.33±11.37。與sham組相比，

7、HG明顯升高（P<0.01），ND顯著降低（P<0.01）。CIP+Ⅱ組各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)無明顯DND，7d時(shí)HG，為0～Ⅰ級，ND為190.67±4.16。與Ⅱ組相比，HG明顯降低（P<0.01），ND顯著升高（P<0.01）。表明CIP可以誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生腦缺血耐受，使其能夠抵抗通常會(huì)引起明顯DND的嚴(yán)重腦缺血。CA3區(qū)的椎體神經(jīng)元，在各組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未見到明顯損傷。
　　 2磷酸化p38 MAPK在大鼠海馬C

8、A1區(qū)的表達(dá)
　　 2.1同組不同時(shí)間點(diǎn)的比較
　　 sham組海馬CA1區(qū)免疫陽性細(xì)胞形態(tài)完整，胞核胞漿界限不清，為淺棕黃色。各時(shí)間總面積和平均光密度均無顯著性差異。
　　 CIP組在15min時(shí)胞核著色開始變深，3h、1d時(shí)胞核明顯，呈深棕黃色，以3h最為明顯，此后神經(jīng)元胞核著色逐漸變淺，至7d時(shí)回落至即刻取材時(shí)間點(diǎn)水平。與即刻取材時(shí)間點(diǎn)相比，p-p38 MAPK陽性標(biāo)記物的總面積在15min～4d均明顯增高

9、，但以1d最顯著，平均光密度在15min～1d時(shí)明顯升高，以3h最顯著（p<0.05）。
　　 Ⅱ組在即刻取材時(shí)間點(diǎn)免疫陽性物質(zhì)表達(dá)量少，15min開始逐漸增多，3h、1d達(dá)高峰，胞核呈均勻的深棕黃色。與即刻取材時(shí)間點(diǎn)相比，其陽性標(biāo)記物的總面積和平均光密度在15min～2d均明顯升高（p<0.05），其中總面積以1d為最顯著，平均光密度以3h最顯著。4d和7d時(shí)表達(dá)量明顯降低，并有少量膠質(zhì)細(xì)胞著色，且著色程度明顯比神經(jīng)元深，與即

10、刻取材時(shí)間點(diǎn)相比，其染色總面積和平均光密度沒有明顯變化。
　　 CIP+Ⅱ組，即刻取材時(shí)間點(diǎn)可見免疫陽性物質(zhì)有一定量表達(dá)。15min時(shí)陽性標(biāo)記物的表達(dá)明顯減少，細(xì)胞較稀疏，與即刻取材時(shí)間點(diǎn)相比陽性細(xì)胞的染色面積明顯減少（19<0.05），而平均光密度沒有明顯變化。30min時(shí)免疫陽性細(xì)胞表達(dá)開始增多基本和即刻取材時(shí)間點(diǎn)持平，胞核著色也開始加深至3h、1d、2d時(shí)神經(jīng)元著色明顯加深（p<0.05），以2d最為明，4d時(shí)神經(jīng)元著色明

11、顯變淺，基本恢復(fù)至對照組水平，并持續(xù)至7d。
　　 2.2同一時(shí)間點(diǎn)不同組之間比較
　　 即刻取材時(shí)間點(diǎn)，sham組、CIP組和Ⅱ組其免疫陽性標(biāo)記物的總面積和平均光密度三組之間沒有明顯差異；CIP+Ⅱ其陽性標(biāo)記物的總面積與Ⅱ組相比明顯升高，而平均光密度沒有明顯差異。
　　 在15min時(shí)， CIP組、Ⅱ組與sham組相比陽性標(biāo)記物的總面積和平均光密度均明顯升高（p<0.05），Ⅱ組陽性標(biāo)記物總面積升高更明顯。CI

12、P+Ⅱ組與Ⅱ組比較免疫陽性細(xì)胞表達(dá)減少，其染色總面積、平均光密度均明顯降低。
　　 30min時(shí)，CIP組、Ⅱ組與sham組相比其染色總面積、平均光密度均明顯增高（p<0.05）。Ⅱ組與CIP組相比，其免疫陽性標(biāo)記物總面積、平均光密度均明顯升高。CIP+Ⅱ組與Ⅱ組比較陽性標(biāo)記物的平均光密度明顯降低、但總面積沒有明顯變化。
　　 3h～2d時(shí)，CIP組、Ⅱ組與對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的sham組相比，陽性標(biāo)記物的總面積和平均光密度均明顯

13、升高，但Ⅱ組升高的更為顯著。CIP+Ⅱ與同時(shí)間點(diǎn)的Ⅱ組相比，其陽性標(biāo)記物總面積在1d和2d時(shí)均明顯減少（p<0.05）。
　　 4d時(shí)，與sham組比較，CIP組的陽性標(biāo)記物總面積、平均光密度均明顯增高（p<0.05）；Ⅱ組由于細(xì)胞發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，其陽性標(biāo)記物總面積較小，但平均光密度明顯增高（p<0.05）。CIP+Ⅱ組與Ⅱ組比較陽性染色總面積明顯升高。
　　 7d時(shí)，與sham組比較，CIP組的陽性標(biāo)記物總面積明

14、顯增高（p<0.05）。Ⅱ組的總面積與sham組比較無明顯差異。CIP+Ⅱ組的陽性標(biāo)記物總面積比Ⅱ組明顯增高（p<0.05）。
　　 3 p-p38 MAPK在海馬CA3區(qū)的表達(dá)
　　 sham組的各時(shí)間點(diǎn)之間相比，p-p38 MAPK陽性標(biāo)記物總?cè)旧娣e和平均光密度沒有顯著差異。
　　 CIP組，與即刻取材時(shí)間點(diǎn)相比，在1d時(shí)免疫陽性標(biāo)記物總面積明顯增多（p<0.05），胞核深染，平均光密度也明顯升高（p<0.

15、05）。
　　 Ⅱ組，與即刻取材時(shí)間點(diǎn)比較，p-p38 MAPK陽性標(biāo)記物的總面積在30min～2d時(shí)均明顯升高（p<0.05）以2d最為突出。
　　 CIP+Ⅱ組，在即刻取材時(shí)間點(diǎn)，胞核著色均勻一致，染色為淺棕黃色，15min時(shí)胞核染色明顯加深（p<0.05），但陽性標(biāo)記物的總面積和即刻取材時(shí)間點(diǎn)比較明顯降低（p<0.05）。30min～1d免疫陽性細(xì)胞表達(dá)較15min時(shí)有所增多，但仍明顯低于即刻取材時(shí)間點(diǎn)水平。在2d

16、時(shí)，陽性標(biāo)記物的總?cè)旧娣e升高到即刻時(shí)間點(diǎn)水平，胞核深染，與即刻點(diǎn)比較p-p38 MAPK免疫陽性細(xì)胞的總?cè)旧娣e沒有明顯變化，平均光密度顯著增高（p<0.05）。4d、7d時(shí)免疫陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，細(xì)胞輪廓不清，胞核著色明顯變淺，與即刻取材時(shí)間點(diǎn)比較，免疫陽性細(xì)胞的總?cè)旧娣e和平均光密度均明顯降低（p<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1缺血打擊可以使海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性死亡，提前2天的3min缺血預(yù)處理

17、可以防止這種死亡的發(fā)生，說明缺血預(yù)處理能夠誘導(dǎo)腦缺血耐受從而保護(hù)神經(jīng)元免受缺血打擊的影響。
　　 2缺血預(yù)處理可使大鼠海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)錐體神經(jīng)元磷酸化的p38 MAPK表達(dá)適度增多，該變化可能保護(hù)海馬錐體神經(jīng)元使其能夠耐受之后的缺血打擊。
　　 3缺血打擊可使海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK的表達(dá)大量增多，提示p-p38 MAPK的過度表達(dá)可能參與腦缺血損傷機(jī)制。
　　 4提前2d的3min缺血預(yù)處理可以防