NF-κB在腦缺血預(yù)處理激活p38MARK上調(diào)GLT-1表達(dá)誘導(dǎo)腦缺血耐受中發(fā)揮作用.pdf

1、目的：預(yù)先給予短暫、輕微、不至于引起神經(jīng)元損傷的腦缺血預(yù)處理，可以減少缺血.再灌注損傷，產(chǎn)生腦缺血耐受。腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受，已被大量的研究所證實(shí)，但其發(fā)生機(jī)制至今尚未闡明。NF-κB是從B淋巴細(xì)胞核中檢測(cè)到的一種能與免疫球蛋κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合的核蛋白因子。非活化狀態(tài)NF-κB以IκB聚合的三聚體形式或與前體蛋白聚合的二聚體形式存在于胞漿中，在缺血缺氧等刺激作用下，通過(guò)多種信號(hào)途徑IκB發(fā)生磷酸化并與NF-κB解聚

2、，NF-κB被激活，將信息從胞漿傳至胞核并啟動(dòng)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。此外，有的研究發(fā)現(xiàn)，還有一些獨(dú)立于IκB的信號(hào)，如p38 MAPK可以對(duì)NF-κB進(jìn)行磷酸化修飾，調(diào)節(jié)其活性，使其更有效地促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[12]。我室既往研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血預(yù)處理通過(guò)p38 MAPK通路上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glialglutamate transporter-1，GLT-1)大量表達(dá)而誘導(dǎo)腦缺血耐受；NF-κB的特異性抑制劑BAY11-7082劑量

3、依賴性阻斷腦缺血預(yù)處理所誘導(dǎo)的腦缺血耐受。但腦缺血預(yù)處理是否通過(guò)p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響NF-κB信號(hào)通路而引起GLT-1的大量表達(dá)，尚有待闡明。為此，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察NF-κB在腦缺血預(yù)處理激活p38 MAPK上調(diào)GLT-1表達(dá)誘導(dǎo)腦缺血耐受中是否發(fā)揮作用。
　　方法：健康雄性Wistar大鼠(280～320g)198只，首先永久凝閉椎動(dòng)脈，恢復(fù)2天后，隨機(jī)分為以下三部分：
　　1腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中NF

4、-κB p50、NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物、NF-κB DNA結(jié)合活性的變化
　　具體分組如下：①sham組(n=27)：只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不阻斷血流；②腦缺血預(yù)處理(cerebral ischemic preconditioning，CIP)組(n=27)：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min，然后恢復(fù)血流再灌注；③損傷性缺血(ischemicinsult，Ⅱ)組(n=27)：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min，然后恢復(fù)血流再灌注；

5、④CIP+Ⅱ組(n=27)：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min作為腦缺血預(yù)處理，再灌注2天后，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min作為損傷性缺血，然后恢復(fù)再灌注。各組均分為9個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即假手術(shù)或末次缺血后0 min、15 min、30 min、3h、6 h、1 d、2 d、4 d、7 d(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=3)。
　　在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，斷頭取海馬腦組織，應(yīng)用western blot方法來(lái)觀察NF-κB p50蛋白表達(dá)的變化，免疫共沉淀(Co-immuno

6、precipitation)方法來(lái)觀察NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物表達(dá)的變化，采用電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)觀察NF-κB DNA結(jié)合活性的變化。
　　2 p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580對(duì)腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中NF-κB p50、NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物、NF-κB DNA結(jié)合活性的影響
　　具體分

7、組如下：①DMSO+CIP+Ⅱ組(n=18)；②SB203580+CIP+Ⅱ(n=18)。腦缺血預(yù)處理前30 min側(cè)腦室注射3％DMSO或SB2035805nmol，然后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3 min作為腦缺血預(yù)處理，再灌注2天后，再次夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min作為損傷性缺血，而后恢復(fù)再灌注。
　　于末次缺血后即刻(0 min)、3 h、6 h、1 d、4 d、7d時(shí)取海馬腦組織(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=3)，探討p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

8、對(duì)NF-κB p50蛋白、NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物、NF-κB DNA結(jié)合活性的影響。
　　3 NF-κB的特異性抑制劑BAY11-7082對(duì)腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中GLT-1蛋白表達(dá)的影響
　　具體分組如下：@DMSO+CIP+Ⅱ組(n=18)；②BAY11-7082+CIP+Ⅱ(n=36)。腦缺血預(yù)處理前30分鐘側(cè)腦室注射3％DMSO或BAY11-7082，再灌注2天后，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min作

9、為損傷性缺血，而后恢復(fù)再灌注。根據(jù)BAY11-7082劑量不同，又分成1.25 nmol、2.5nmol2個(gè)亞組，每個(gè)亞組n=18。
　　于末次缺血后即刻(0 min)、3 h、6 h、1 d、4 d、7 d時(shí)取海馬腦組織(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=3)，采用Western blot法觀察GLT-1蛋白的表達(dá)，研究NF-κB的特異性抑制劑BAY11-7082對(duì)GLT-1蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受

10、過(guò)程中NF-κB p50的表達(dá)及SB203580對(duì)其影響
　　采用Western blot方法觀察了在腦缺血耐受誘導(dǎo)過(guò)程中，大鼠海馬CA1區(qū)NF-κB p50蛋白的的表達(dá)。
　　Sham組，即刻(0 min)時(shí)間點(diǎn)NF-κB p50有一定量的表達(dá)，但表達(dá)量較少。與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，其余各時(shí)間NF-κB p50表達(dá)量均未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。
　　CIP組3 min全腦缺血后，即刻(0 min)時(shí)間點(diǎn)NF-κB p

11、50蛋白的表達(dá)量較少。與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，15 min、30 min時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)有所上調(diào)，但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；3 h、6 h時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)明顯升高(P＜0.05)；其余時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　缺血打擊組在全腦缺血8 min后，NF-κB p50在即刻時(shí)間點(diǎn)既有一定量的表達(dá)。與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，在15 min時(shí)間點(diǎn)NF-κB p50蛋白表達(dá)有所上調(diào)(P＜0.05)，30 min時(shí)間點(diǎn)達(dá)到高峰(P＜0.01)；

12、3 h、6 h、1 d、2 d時(shí)間點(diǎn)此蛋白的表達(dá)有所下調(diào)，但仍明顯高于即刻時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)；4 d、7 d時(shí)間點(diǎn)NF-κB p50的表達(dá)與即刻時(shí)間點(diǎn)相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　在DMSO+CIP+Ⅱ組，0 min、3 h、6 h、1 d、4 d、7 d等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)NF-κB p50的表達(dá)均較高。與DMSO+CIP+Ⅱ組各個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，SB203580+CIP+Ⅱ組NF-κB p50蛋白的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降

13、低(P＜0.05)。表明，p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580能夠有效抑制腦缺血耐受誘導(dǎo)過(guò)程中NF-κB p50的上調(diào)。
　　2腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物的表達(dá)及SB203580對(duì)其影響
　　通過(guò)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)的方法研究了腦缺血耐受誘導(dǎo)過(guò)程中，大鼠海馬CA1區(qū)NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物的表達(dá)。
　　Sham組N

14、F-κB p50/p65二聚體復(fù)合物在0 min、15 min、30 min、3 h、6 h時(shí)間點(diǎn)有一定數(shù)量的表達(dá)。與0 min時(shí)間點(diǎn)相比，15 min、30 min、3 h、6 h時(shí)間點(diǎn)p50/p65二聚體復(fù)合物的表達(dá)有所上調(diào)，但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；假手術(shù)1 d后NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物的表達(dá)明顯下調(diào)。
　　CIP組3 min全腦缺血后，即刻(0 min)時(shí)間點(diǎn)NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物的表達(dá)

15、量較少。與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，此二聚體復(fù)合物的表達(dá)在15 min時(shí)間點(diǎn)明顯上調(diào)(P＜0.01)。30 min、3 h雖有所下降，但仍明顯高于即刻時(shí)間點(diǎn)(p＜0.05)。6 h、1 d、2 d表達(dá)量維持在一定水平，與即刻時(shí)間點(diǎn)相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。4 d、7 d時(shí)此二聚體復(fù)合物的表達(dá)比即刻時(shí)間點(diǎn)明顯減少(P＜0.05)。
　　缺血打擊組在全腦缺血8 min后，即刻(0 min)時(shí)間點(diǎn)NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物的表達(dá)

16、量較少。與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，NF-κB p50/p65復(fù)合物在15 min、30 min、3 h表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，p50/p65核轉(zhuǎn)移明顯增強(qiáng)，以30 min最為顯著。其余時(shí)間點(diǎn)與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　在CIP+缺血打擊組，即刻(0 min)時(shí)間點(diǎn)NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物有一定的表達(dá)量，但表達(dá)量較少。與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，此二聚體復(fù)合物在15 min、30 min、3 h、6 h

17、表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)；1 d、2 d時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)雖有所下調(diào)，但仍顯著高于即刻時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)。4 d、7 d時(shí)此二聚體復(fù)合物的表達(dá)與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　在DMSO+CIP+Ⅱ組中，0 min、3 h、6 h、1 d、4 d、7 d等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)NF-κB p50/p65二聚體復(fù)合物表達(dá)均較高。與DMSO+CIP+Ⅱ組各個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，SB203580+CIP+Ⅱ組的NF-κB p50

18、/p65二聚體復(fù)合物的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，5 nmol p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580能夠有效阻斷腦缺血耐受誘導(dǎo)過(guò)程中核內(nèi)NF-κB p50/p65二聚體數(shù)量的上調(diào)。
　　3腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中NF-κB的DNA結(jié)合活性及SB203580對(duì)其影響
　　我們采用電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA

19、)的方法檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)胞核內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性。
　　在CIP組，即刻(0 min)時(shí)間點(diǎn)NF-κB具有一定的DNA結(jié)合活性。與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，NF-κB在15 min時(shí)活性顯著增強(qiáng)，并且達(dá)到高峰(P＜0.01)。30 min、3 h雖有所下降，但仍明顯高于即刻時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)。6 h、1 d、2 d時(shí)結(jié)合活性維持在一定水平，與即刻時(shí)間點(diǎn)相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。4 d、7 d時(shí)NF-κB結(jié)合活性比即刻時(shí)

20、間點(diǎn)明顯降低(P＜0.05)。
　　缺血打擊組在全腦缺血8 min后，即刻(0 min)時(shí)間點(diǎn)NF-κB具有一定的DNA結(jié)合活性。與即刻時(shí)間點(diǎn)相比，大鼠海馬CA1區(qū)NF-κB活性在15 min、30 min、3 h顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，以30 min較為顯著；其余時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　在CIP+缺血打擊組，CIP+缺血打擊組NF-κB的DNA結(jié)合活性。即刻(0 min)時(shí)間點(diǎn)NF-κB具有一定的DNA

21、結(jié)合活性。與即刻時(shí)間點(diǎn)相比NF-κB活性在15 min開(kāi)始增強(qiáng)，于30 min、3 h明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，在6 h達(dá)到高峰；1 d、2 d時(shí)間點(diǎn)雖有所降低，但仍顯著高于即刻時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)。4 d、7 d時(shí)間點(diǎn)NF-κB活性與即刻時(shí)間點(diǎn)相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　在DMSO+CIP+Ⅱ組中，0 min～7 d的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)NF-κB的DNA結(jié)合活性均較高。與DMSO+CIP+Ⅱ組各個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，SB2035

22、80+CIP+Ⅱ組的NF-κB的活性在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低(P＜0.01)。上述結(jié)果表明，5nmol p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580能夠有效阻斷腦缺血耐受誘導(dǎo)過(guò)程中核內(nèi)NF-κB的DNA結(jié)合活性上調(diào)。
　　4腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中NF-κB的特異性抑制劑BAY11-7082對(duì)GLT-1蛋白表達(dá)的影響
　　采用Western blot方法觀察了在腦缺血耐受誘導(dǎo)過(guò)程中，NF-κB的特異性抑制劑BAY11

23、-7082對(duì)GLT-1蛋白表達(dá)的影響。
　　在DMSO+CIP+Ⅱ組，0 min、3 h、6 h、1 d、4 d、7 d共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)GLT-1的表達(dá)均較高。與DMSO+CIP+Ⅱ組各個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，1.25nmolBAY11-7082+CIP+Ⅱ組GLT-1蛋白的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低(P＜0.05)。2.5 nmol BAY11-7082亦導(dǎo)致GLT-1蛋白的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，NF-

24、κB的特異性抑制劑BAY11-7082能夠顯著下調(diào)GLT-1的表達(dá)。
　　小結(jié)：
　　1在體腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受過(guò)程中，NF-κB被激活，即表現(xiàn)為：NF-κB p50蛋白表達(dá)上調(diào)；NF-κB發(fā)生二聚體化，并由胞漿轉(zhuǎn)位至胞核；NF-κB的DNA結(jié)合活性增強(qiáng)。
　　2 p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580下調(diào)該過(guò)程中NF-κB p50蛋白的表達(dá)、下調(diào)NF-κB p50/p65的表達(dá)二聚體復(fù)合物的表達(dá)、抑制N