SirT1在高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：目前治療腦中風(fēng)的藥物和方法有限且效果不佳，缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為腦中風(fēng)的防治開辟了全新的思路,但由于方法的局限性，缺血預(yù)處理很難運(yùn)用于臨床腦保護(hù)。本研究室前期的研究已證實(shí)，高壓氧預(yù)處理（HBO-PC）能夠誘導(dǎo)腦和脊髓的缺血耐受，可以顯著地模擬缺血預(yù)處理的腦保護(hù)作用。因其安全、可行，有望成為臨床上預(yù)防和減輕腦缺血再灌注損傷的有效方法，并已有研究報(bào)道將高壓氧預(yù)處理用于臨床預(yù)防冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)病人的心肌缺血再灌注損傷。我們以

2、往的研究表明，HBO-PC通過刺激機(jī)體產(chǎn)生少量的氧自由基，上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶，誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用。然而，HBO-PC誘導(dǎo)腦缺血耐受的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，臨床上如何合理應(yīng)用HBO-PC防治腦缺血損傷仍需科學(xué)理論依據(jù)。
　　蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾包括磷酸化與去磷酸化、乙酰化與去乙?；⒓谆c去甲基化，腺苷化與去腺苷化，以及-S-S-（氧化）與-SH（還原）等，共價(jià)修飾可以改變蛋白質(zhì)的活性。過去的研究多集中在蛋白的磷酸化和去磷酸化作用，但

3、近年來的研究發(fā)現(xiàn)乙?；腿ヒ阴；瘜?duì)蛋白質(zhì)的功能同樣有著重要的調(diào)節(jié)作用。SirT1作為第三類去乙?；?，可以活化多種在細(xì)胞存活信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。尤其在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，SirT1能夠顯著地促進(jìn)細(xì)胞存活。自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的分解代謝過程，通過自噬途徑可將細(xì)胞內(nèi)衰老和損傷的細(xì)胞器以及錯(cuò)誤折疊蛋白分解代謝成可利用的氨基酸，核苷酸等，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。有研究表明，SirT1參與了預(yù)處理對(duì)大鼠海馬切片氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用，并且自噬活化與缺

4、血預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受有著密切的關(guān)系。此外，另有研究報(bào)道SirT1通過去乙?；允上嚓P(guān)蛋白，調(diào)節(jié)自噬體的形成。
　　基于上述發(fā)現(xiàn)我們推測(cè)，HBO-PC通過促進(jìn)少量氧自由基生成，上調(diào)SirT1的表達(dá)，活化SirT1下游轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)自噬途徑，產(chǎn)生腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠局灶性腦缺血模型和大鼠腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪模型，運(yùn)用體內(nèi)siRNA干涉及體外重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，對(duì)HBO-PC腦保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。
　　實(shí)驗(yàn)一S

5、irT1在HBO-PC誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受中的作用
　　目的：探討SirT1在HBO-PC腦保護(hù)中的作用
　　方法：1）HBO-PC腦缺血半暗帶區(qū)SirT1的表達(dá)。選擇成年雄性SD大鼠，采用線栓法右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻閉（MCAO）為局灶性腦缺血模型。連續(xù)5天高壓氧預(yù)處理（2.5ATA，100％O2，1h·d-1）后24h行MCAO120min，然后再灌注24h。檢測(cè)缺血前、再灌注后1、3、6、12、24h時(shí)間點(diǎn)SirT1蛋白的表達(dá)

6、以及再灌注后3hSirT1的mRNA表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)定位。2）SirT1對(duì)HBO-PC腦保護(hù)作用的影響。應(yīng)用SirT1激動(dòng)劑、抑制劑及SirT1siRNA分別上調(diào)和下調(diào)SirT1，檢測(cè)再灌注后24h大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死容積。SirT1激動(dòng)劑白藜蘆醇灌胃，50mg·kg-1，1次·d-1，15天；SirT1抑制劑EX527分1、10、30μg三個(gè)劑量于HBO-PC前行側(cè)腦室注射，連續(xù)5天；側(cè)腦室注射SirT1siRNA，5μg，1

7、6μl，注射后1～7天檢測(cè)腦組織中SirT1的表達(dá)。
　　結(jié)果：HBO-PC能夠改善大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，縮小腦梗死容積。與缺血再灌注損傷相比，HBO-PC顯著增加SirT1的蛋白和mRNA表達(dá)。從再灌注后3h開始SirT1蛋白表達(dá)增加，至少可持續(xù)至24h，且主要是在腦缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞核中。10μg和30μgEX527能夠逆轉(zhuǎn)HBO-PC的腦保護(hù)作用。相反，白藜蘆醇治療能夠改善其后發(fā)生的腦缺血再灌注損傷的神

8、經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，縮小腦梗死容積，與HBO-PC的腦保護(hù)作用相同。SirT1siRNA抑制HBO-PC誘導(dǎo)的SirT1的增加，消除了HBO-PC的腦保護(hù)作用。
　　結(jié)論：HBO-PC通過上調(diào)SirT1的表達(dá)，減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷。
　　實(shí)驗(yàn)二SirT1在HBO-PC誘導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)元缺血耐受中的作用
　　目的：探討SirT1在HBO-PC神經(jīng)元保護(hù)中的作用
　　方法：1）HBO-PC對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。取孕

9、16-18天SD大鼠胚胎的大腦皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)。培養(yǎng)至第8天行HBO-PC（3.5ATA，氧濃度>90％）處理120min，24h后進(jìn)行氧糖剝奪（OGD）（95％N2，5％CO2）120min，復(fù)氧24h，檢測(cè)細(xì)胞存活率（MTT）和乳酸脫氫酶（LDH）漏出率。2）SirT1在HBO-PC、氧糖剝奪（OGD）損傷神經(jīng)元中的表達(dá)。OGD/復(fù)氧（OGD/R）后24h檢測(cè)SirT1的蛋白表達(dá)。3）SirT1對(duì)HBO-PC神經(jīng)元保護(hù)作用的影響。

10、采用重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染技術(shù)，將攜帶有SirT1基因（Ad-SirT1）和SirT1siRNA（Ad-siRNA-SirT1）的腺病毒轉(zhuǎn)入神經(jīng)元，上調(diào)和下調(diào)SirT1的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48h檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后SirT1的表達(dá)。Ad-siRNA-SirT1轉(zhuǎn)染48h后給予HBO-PC。OGD120min、復(fù)氧24h后檢測(cè)MTT和LDH漏出率。結(jié)果：大鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第6天，免疫熒光染色純度鑒定顯示，神經(jīng)元純度>95％。HBO-PC增加神

11、經(jīng)元OGD/R損害后24h細(xì)胞存活率，降低LDH漏出率。與OGD損傷相比，復(fù)氧后24hHBO-PC增加SirT1的表達(dá)。在MOI為10、50、100的條件下，重組腺病毒Ad-SirT1轉(zhuǎn)染效率依次為30％、88％、95％。Ad-siRNA-SirT1轉(zhuǎn)染效率依次為20％、60％、80％。
　　Ad-SirT1轉(zhuǎn)染后48hSirT1蛋白表達(dá)顯著增加；Ad-siRNA-SirT1轉(zhuǎn)染SirT1顯著降低。OGD/R后24h，Ad-Sir

12、T1轉(zhuǎn)染上調(diào)SirT1蛋白表達(dá)，細(xì)胞存活率增加，LDH漏出率降低。Ad-siRNA-SirT1轉(zhuǎn)染抑制HBO-PC誘導(dǎo)的SirT1的增加，HBO-PC的神經(jīng)元保護(hù)作用消失。
　　結(jié)論：HBO-PC通過上調(diào)SirT1的表達(dá)，減輕體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元的OGD/R損傷。
　　實(shí)驗(yàn)三自噬在HBO-PC誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受中的作用
　　目的：探討自噬在HBO-PC腦保護(hù)中的作用
　　方法：1）HBO-PC腦缺血半暗帶區(qū)自噬

13、的表達(dá)。選擇成年雄性SD大鼠，給予HBO-PC和MCAO處理。檢測(cè)缺血前、再灌注后1、3、6、12、24h時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)變化以及再灌注后6hBeclin1的表達(dá)和自噬體的形成以及免疫熒光雙標(biāo)定位。2）自噬對(duì)HBO-PC腦保護(hù)作用的影響。分別應(yīng)用自噬抑制劑和激動(dòng)劑抑制和活化自噬，缺血再灌注后6h檢測(cè)LC3-II和Beclin1蛋白表達(dá)。再灌注后24h檢測(cè)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死容積。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）3

14、0μg于HBO-PC前行側(cè)腦室注射，連續(xù)5天；自噬激動(dòng)劑雷帕霉素，30ng單次側(cè)腦室注射，24h后行MCAO。結(jié)果：HBO-PC增加LC3-II和Beclin1蛋白表達(dá)和自噬體的形成，LC3-II從再灌注后3h開始增加至少可持續(xù)至24h。LC3表達(dá)主要是在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中。3-MA抑制HBO-PC誘導(dǎo)的LC3-II和Beclin1的上調(diào)，逆轉(zhuǎn)HBO-PC的腦保護(hù)作用。雷帕霉素側(cè)腦室注射上調(diào)LC3-II和Beclin1的表達(dá)，減輕其后發(fā)生的