熱休克蛋白-70在腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受中的作用及其機制的實驗研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：研究局部腦缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning[PC])、HSP70的表達和對隨后發(fā)生的局灶腦缺血的保護作用。
　　 方法：應(yīng)用改進的Longa’s法，建立大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)的局部腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受 (ischemic tolerance[IT])模型。MCAO20min作為PC，分別在再灌注12h、1d、3d、5d、7d、14d后造成永久性MCAO(PM

2、CAO)并與未行PC的假手術(shù)組對照。檢測以下指標：TTC染色測量梗死體積；神經(jīng)功能缺失評分；HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)變化；同時應(yīng)用原位雜交、免疫組織化學(xué)染色和RT-PCR、Western blotting觀察PC后HSP70表達的變化。每小組動物5只。
　　 結(jié)果：PC組1d、3d、5d、7d與未行PC組比較，PMCAO后24h腦梗死體積明顯減小(P<0.01)，神經(jīng)功能缺損明顯減輕(P<0.05)；PC后不同時間點與假手術(shù)組比較缺

3、血區(qū)HSP70mRNA(12h、1d、3d、5d)(P<0.01)和蛋白(1d、3d、5d、7d)的表達明顯增加(P<0.05)。
　　 結(jié)論：PC可以充分誘導(dǎo)其后1～7d的腦缺血耐受，同時PC誘導(dǎo)HSP70表達，可能與缺血耐受的產(chǎn)生有關(guān)。
　　 第二部分
　　 目的：探討HSP70蛋白合成在腦缺血預(yù)處理(PC)誘導(dǎo)腦缺血耐受(IT)中的作用和對細胞凋亡的影響。
　　 方法：應(yīng)用改進的Longa’s法建立

4、大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)的局部腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受(IT)模型。MCAO20min作為PC，PC后24h給予永久性MCAO(PMCAO),并與未進行PC假手術(shù)組比較。免疫印記(Western blotting)法測量PC24h后HSP70的變化,TUNEL法、流式細胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測大鼠前腦皮質(zhì)細胞的凋亡；同時觀察在PC前或PC后PMCAO前給予蛋白合成抑制劑放線菌酮對PC后24h HSP70、

5、PMCAO后24h腦梗死體積、神經(jīng)功能評分和細胞凋亡的影響。每組動物5只。
　　 結(jié)果：PC組PMCAO后24h腦梗死體積明顯減小(P<0.01),神經(jīng)功能評分降低(P<0.05)、細胞凋亡數(shù)和凋亡率降低(P<0.05)；PC前給予放線菌酮消除了以上影響，但在PC后較長時間而在PMCAO之前給予則沒有以上影響；HSP70在PC后1d明顯表達，而在PC前30min給予放線菌酮抑制了HSP70的表達(P<0.05)。
　　

6、結(jié)論：HSP70的合成在PC誘導(dǎo)腦缺血耐受中發(fā)揮重要作用，可能是通過抑制神經(jīng)細胞凋亡實現(xiàn)的。
　　 第三部分
　　 目的：探討HSP70在缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受中抑制細胞凋亡的機制。
　　 方法：應(yīng)用改進的Longa’s法建立大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)局部腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受(IT)模型。MCAO20min作為PC，PC后24h給予永久性MCAO(PMCAO)，并與未進行PC假手術(shù)組比較。免疫組織化學(xué)

7、和免疫印記(Western blotting)法測量PMCAO24h后c-fos、bcl-2和caspase-3的變化,同時觀察在PC前給予蛋白合成抑制劑放線菌酮對c-fos、bcl-2和caspase-3的影響。
　　 結(jié)果：PC-PMCAO組PMCAO后24h c-fos、bcl-2表達增加，caspase-3表達減少，與假手術(shù)(SS-PMCAO)組比較均有顯著行差異(P<0.05)。PC前給予放線菌酮消除了以上影響。

8、>　　 結(jié)論：HSP70在PC誘導(dǎo)腦缺血耐受中抗神經(jīng)細胞凋亡的作用可能是通過促進再缺血后c-fos bcl-2的表達、抑制caspase-3的表達實現(xiàn)的。
　　 第四部分
　　 目的：研究氧-糖剝奪預(yù)處理和HSP70表達在誘導(dǎo)體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞缺血耐受中的作用.
　　 方法：原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)細胞進行非致死性氧-糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation[OGD])20min作為預(yù)處理(is

9、chemic preconditioning[PC])，分別在PC后12h、24h、48h、72h進行第二次致死性O(shè)GD50min,建立體外缺血耐受模型。致死行OGD后24h測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase[LDH])檢測神經(jīng)元損傷的程度、臺盼蘭染色檢測神細胞死亡率；RT-PCR、免疫組織化學(xué)、Western blotting測定PC后HSP70的表達；同時測定在PC前30min或PC后較長時間而在致死性O(shè)GD

10、前應(yīng)用放線菌酮對神經(jīng)細胞損傷和在PC前30min應(yīng)用放線菌酮對HSP70蛋白的影響。
　　 結(jié)果：與致死性O(shè)GD組比較PC-OGD組OGD后24h、48h LDH水平明顯減低(P<0.05)、神經(jīng)細胞死亡數(shù)減少(P<0.05)，同時PC后12h、24h、48h HSP70mRNA的表達增加(P<0.05)，24h、48h HSP70蛋白的表達增加(P<0.01)，而PC后12h、72h組則無變化。在PC前應(yīng)用放線菌酮消除了PC-

11、OGD組OGD后24h上述指標的變化，而在PC后較長時間應(yīng)用放線菌酮對此則無影響。同時PC前應(yīng)用放線菌酮抑制了HSP70蛋白的表達(P<0.05)。
　　 結(jié)論：20min OGD預(yù)處理成功的誘導(dǎo)了體外皮層神經(jīng)細胞的缺血耐受，這種作用可能與HSP70的高表達有關(guān)。
　　 第五部分
　　 目的：探討氧-糖剝奪預(yù)處理對體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞凋亡的保護作用及機制方法原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)細胞進行非致死行的氧-糖剝奪(Oxyg

12、en-glucose deprivation[OGD])20min作為預(yù)處理(ischemic preconditioning[PC])，在PC后24h進行第二次OGD50min,建立體外缺血耐受模型。流式細胞儀、TUNEL法，吖啶橙熒光染色測定致死行OGD后24h細胞凋亡率和凋亡細胞數(shù)。免疫組織化學(xué)和免疫印跡測定致死行OGD后24h bcl-2、caspase-3的表達。
　　 結(jié)果：與對照組相比PC-OGD組致死性O(shè)GD后2