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文檔簡介
1、目的:缺血性腦血管病是臨床上常見病、多發(fā)病之一,死亡率和致殘率均較高,嚴(yán)重危害著人類的健康。特別是神經(jīng)細(xì)胞對缺血性損害非常敏感,長時間的缺血打擊使得神經(jīng)細(xì)胞大量死亡,難以再生,從而留下許多嚴(yán)重甚至是不可逆性的后遺癥。因此,調(diào)動機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,提高神經(jīng)細(xì)胞對缺血性損害的抵抗力,使其在蒙受較嚴(yán)重的缺血狀態(tài)下減輕損傷,保持存活,保證恢復(fù)血液供應(yīng)后這些神經(jīng)細(xì)胞仍具有正常生理功能,是缺血性腦血管病治療上的一個重要策略。1990年,日本學(xué)者K
2、itagiwa等首先發(fā)現(xiàn),預(yù)先給予沙土鼠輕微、短時、不致引起神經(jīng)元死亡的腦缺血,可減輕再次損傷性缺血引起的CA1區(qū)神經(jīng)元死亡,此種現(xiàn)象稱為腦缺血耐受(brain ischemic tolerance),提前給予的亞致死性腦缺血稱為腦缺血預(yù)處理(brain ischemic preconditioning)。但是,這種操作很難作為一種腦缺血前的預(yù)防措施進(jìn)入臨床應(yīng)用,因此人們不斷探索新的有效的腦缺血預(yù)處理措施。研究表明,應(yīng)用藥物模擬或誘導(dǎo)一
3、些物質(zhì)如腺苷、HSP等的表達(dá),可使神經(jīng)細(xì)胞對缺血性損傷產(chǎn)生對抗作用。
熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)亦稱應(yīng)激蛋白,是在生理或病理應(yīng)激狀態(tài)下于細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)合成的蛋白質(zhì),對應(yīng)激細(xì)胞起保護(hù)作用。其中分子量為70kd的HSP家族是最保守的HSP,其在正常細(xì)胞中水平較低,應(yīng)激狀態(tài)下顯著升高,因而成為HSPs中最被關(guān)注、研究最深入的一種。作為非器官特異性應(yīng)激蛋白,HSP70可能有助于神經(jīng)元缺血耐受的形成。
4、r> 恩必普(Butylphhtalide或Dinbente,簡稱NBP)即消旋-3-正丁基苯酞軟膠囊是我國成功制出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的治療急性缺血腦卒中的一類化學(xué)新藥。本實(shí)驗應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血模型,觀察恩必普預(yù)處理對全腦缺血-再灌注引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的影響,探討恩必普預(yù)處理的腦保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察恩必普預(yù)處理后全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)HSP70的表達(dá)情況,以及應(yīng)用HSP70合成抑制劑槲皮素對海馬
5、CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的影響,探討HSP70在恩必普預(yù)處理抗腦缺血再灌注損傷中的作用及恩必普腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。
方法:
1、恩必普預(yù)處理對大鼠全腦缺血再灌注引起的海馬錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的影響
應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血模型,36只大鼠椎動脈凝閉后隨機(jī)分為4組:①Sham組(n=6):游離雙側(cè)頸總動脈,但不夾閉;②恩必普預(yù)處理組(n=6):恩必普30mg/kg灌胃;③腦缺血組(n=6):夾
6、閉雙側(cè)頸總動脈8 min致全腦缺血;④恩必普預(yù)處理+腦缺血組:恩必普預(yù)處理后即刻、1d和2d行8min全腦缺血(共3組,每組n=6)。所有大鼠在sham手術(shù)或末次缺血再灌后7天,斷頭取腦,硫堇染色確定海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(histological grade,HG)和神經(jīng)元密度(neuronal density,ND),以反映遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(delayed neuronal death,DND)情況。
2、恩必普預(yù)處理
7、對缺血再灌注海馬HSP70表達(dá)的影響
應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血模型,90只椎動脈永久凝閉的大鼠隨機(jī)分為3組。(1) sham組:下設(shè)五個亞組:分別為腦缺血sham手術(shù)后6h、12h、1d、3d、5d組(每組n=6)。(2)腦缺血組:全腦缺血8 min。下設(shè)五個亞組:分別為腦缺血后6h、12h、1d、3d、5d組(每組n=6)。(3)恩必普+腦缺血組:恩必普預(yù)處理1d后行全腦缺血8 min;下設(shè)五個亞組:分別為腦缺血后6h
8、、12h、1d、3d、5d組(每組n=6)。所有動物于規(guī)定時間點(diǎn)斷頭取材,石蠟包埋,連續(xù)切片,免疫組織化學(xué)染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)HSP70的表達(dá)。
3、HSP70抑制劑Quercetin對恩必普預(yù)處理的腦保護(hù)作用的影響
應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血模型,36只椎動脈永久凝閉的大鼠隨機(jī)分為以下6組:(1) sham組行腦缺血sham手術(shù)(n=6);(2)恩必普預(yù)處理組:恩必普灌胃30mg/kg(n=6);(3)
9、腦缺血組:行全腦缺血8 min;(4)恩必普預(yù)處理+腦缺血組:恩必普預(yù)處理后1d行全腦缺血8 min;(5) Quercetin+恩必普+腦缺血組:恩必普預(yù)處理前30min及恩必普預(yù)處理后即刻、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d分別給與HSP70抑制劑Quercetin(50 mg/kg,腹腔注射),其余同恩必普預(yù)處理+腦缺血組;(6) DMSO+恩必普+腦缺血組:腹腔注射3%的DMSO溶液4 mL/kg,注射時間及其它處理同Qu
10、ercetin+恩必普+腦缺血組。所有動物均于末次手術(shù)后7天斷頭取材,硫堇染色確定海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(histological grade,HG)和神經(jīng)元密度(neuronal density,ND),以反映遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(delayed neuronal death,DND)情況。
結(jié)果:
1、恩必普預(yù)處理減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡
硫堇染色結(jié)果表明
11、sham組和恩必普組大鼠海馬CA1區(qū)無明顯損傷,組織學(xué)分級(histological grade,HG)為0~Ⅰ級,ND分別為193±8.6(cells/mm,下同)、196.8±12。腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)有明顯組織損傷;HG為Ⅱ~Ⅲ級,ND為34.8±8.2,與sham組和恩必普組相比,HG明顯升高,ND明顯減少(p<0.01)。在恩必普預(yù)處理+腦缺血組,恩必普預(yù)處理后1d腦缺血再灌注海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊致密,胞核飽滿,核
12、仁較清晰,僅個別錐體細(xì)胞胞核固縮,無明顯細(xì)胞缺失,與腦缺血組相比,HG(Ⅰ級)明顯降低,ND(165.3±9.3)明顯升高,表明恩必普預(yù)處理對其后1d發(fā)生的腦缺血再灌注損傷有明顯的對抗作用。恩必普預(yù)處理后即刻和2d進(jìn)行腦缺血再灌注,與腦缺血組比較,HG有一定程度降低,ND有一定程度升高(p<0.01),但大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞缺失較多,仍有明顯的組織損傷。
結(jié)果表明恩必普預(yù)處理能夠減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷引起的海馬CA
13、1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡,這種作用在恩必普預(yù)處理后1d最為強(qiáng)大,而在預(yù)處理后即刻及2d對腦缺血再灌注損傷雖有一定的抑制作用,但作用強(qiáng)度明顯減弱。
2、恩必普預(yù)處理上調(diào)腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)HSP70表達(dá)
HSP70陽性表達(dá)產(chǎn)物為棕黃色顆粒,多見于神經(jīng)元胞漿和軸突,有時可見于胞核。sham組海馬神經(jīng)元中少見明顯的HSP70蛋白表達(dá)。單純腦缺血組,CA1區(qū)于再灌注各時間點(diǎn)可見少量HSP70陽性表達(dá);在CA3
14、、CA4區(qū)及齒狀回區(qū)可見大量HSP70陽性表達(dá)。在恩必普+腦缺血組,腦缺血再灌注6h海馬CA1區(qū)可見少量的HSP70表達(dá),12hHSP70表達(dá)增加,再灌注1d后CA1區(qū)HSP70表達(dá)明顯增強(qiáng),數(shù)量增加,達(dá)到高峰,可見大量神經(jīng)元的胞漿及軸突呈棕黃色HSP70陽性染色;再灌注3d后CA1區(qū)HSP70表達(dá)維持在較高水平,但與1d組相比較已開始回落;再灌注5d仍可見到CA1區(qū)少量HSP70陽性表達(dá)。與sham組及TCI組相應(yīng)時間點(diǎn)比較,再灌注后
15、12h、1d、3d、5d海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)、陽性細(xì)胞總面積和平均光密度明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。恩必普預(yù)處理后腦缺血再灌注各個時間點(diǎn)海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞HSP70陽性表達(dá)的情況與腦缺血各組相似。
結(jié)果表明,恩必普預(yù)處理能夠上調(diào)腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)HSP70表達(dá),HSP70表達(dá)在1d達(dá)到高峰。
3、HSP70抑制劑Quercetin能夠抑制恩必普預(yù)處理的腦保護(hù)作用<
16、br> 硫堇染色結(jié)果顯示,sham組和恩必普預(yù)處理組大鼠海馬CA1區(qū)無明顯的DND,HG為0~Ⅰ級,ND分別為200.2±5.1、201.3±5.4。腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的組織損傷,與sham組和恩必普預(yù)處理組比較,HG(Ⅱ-Ⅲ級)明顯升高,ND(44.3±8.3)顯著降低。恩必普預(yù)處理+腦缺血組中,海馬CA1區(qū)未見明顯細(xì)胞損傷,與腦缺血組相比,其HG(1級)明顯降低,ND(157±6.9)值明顯升高,表明恩必普預(yù)處理
17、可誘導(dǎo)產(chǎn)生腦缺血耐受,減輕腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND。給予3%DMSO對恩必普誘導(dǎo)的腦缺血耐受無明顯影響,其HG和ND與恩必普預(yù)處理+腦缺血組相近。然而,給予HSP70合成抑制劑Quercetin則明顯阻斷了恩必普的腦保護(hù)作用,在海馬CA1區(qū)出現(xiàn)了明顯的DND,與恩必普預(yù)處理+腦缺血組相比,其HG明顯升高(Ⅱ-Ⅲ級),ND值明顯降低(122.8±8.2)。
結(jié)果表明,恩必普預(yù)處理后能夠誘導(dǎo)大鼠海馬CA1
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